Целью обследования пациента с подозрением на инфекционное заболевание является подтверждение наличия инфекции, выявление определенного возбудителя (возбудителей) и определение его чувствительности к ряду противомикробных препаратов для оптимизации терапии. Свидетельством наличия инфекции может служить обнаружение антител, вырабатывающихся в ответ на возбудитель, в рамках реакций врожденной иммунной системы и острофазовой воспалительной реакции.

Возможно непосредственное обнаружение патогенов (например, с помощью микробиологического исследования), либо их присутствие может быть установлено путем выявления реакции организма (так называемое косвенное обнаружение) (табл. 4). Аккуратный забор образцов для анализа увеличивает вероятность постановки диагноза (табл. 5).

Результаты микробиологического исследования необходимо интерпретировать с учетом нормальной микрофлоры, присутствующей в месте взятия образца (см. рис. ниже). Степень подтверждения или опровержения определенного диагноза по данным микробиологического теста зависит от его статистических характеристик (например, чувствительности, специфичности, прогностического значения положительного и отрицательного результата).

Чувствительность и специфичность зависят от времени между заражением и проведением обследования, а прогностическое значение положительного и отрицательного результатов зависит от распространенности заболевания в исследуемой популяции. Сложность интерпретации теста проиллюстрирована на рис. ниже, где показаны «диапазоны возможностей» различных методов исследования.

Учитывая эту сложность, для обеспечения точной интерпретации исследования необходимо эффективное сотрудничество между врачом и микробиологом.

а) Непосредственное обнаружение возбудителей заболеваний (прямые методы выявления возбудителей). С помощью некоторых методов прямого обнаружения можно быстро получить результаты и обнаружить микроорганизмы, сложно поддающиеся культивированию на искусственных питательных средах (например, Chlamydia spp.); также данные тесты могут предоставить информацию о чувствительности к противомикробным препаратам, например, для Mycobacterium tuberculosis.

1. Бактериоскопический метод исследования микроорганизмов. Целые клетки микроорганизмов выявляются при исследовании биологических жидкостей или тканей с помощью микроскопа.

• При светлопольной микроскопии (исследуемый образец помещается между источником света и линзой объектива) для улучшения визуального контраста между микроорганизмом и его фоном используется окрашивание. Примеры включают окрашивание бактерий по Граму и окрашивание кислото- и спиртоустойчивых бацилл при ТБ по Цилю—Нильсену или флуорохромирование аурамином (в последнем случае необходим источник ультрафиолетового излучения).

При гистопатологическом исследовании образцов для обнаружения микроорганизмов и оценки патологического процесса в тканях одновременно используется несколько видов окрашивания.

• Темнопольная микроскопия (при которой свет рассеивается, чтобы микроорганизмы казались яркими на темном фоне) применяется, например, для исследования жидкости из шанкров половых органов при подозрении на сифилис.

• Электронная микроскопия позволяет исследовать кал и везикулярную жидкость для обнаружения кишечных и герпес-вирусов соответственно, однако ее использование в значительной степени вытесняется методами обнаружения нуклеиновой кислоты (см. ниже).

• Проточная цитометрия позволяет обнаружить частицы в жидких образцах (например, моче) на основании таких свойств, как размер, импеданс и светорассеяние. Эта методика способна обнаруживать бактерии, но может и ошибочно идентифицировать другие частицы как бактерии.

2. Методы выявления компонентов микроорганизмов. Компоненты микроорганизмов, используемые с диагностической целью, включают нуклеиновые кислоты, молекулы клеточной стенки, токсины и другие антигены. Типичными примерами являются антиген Legionella pneumophila серогруппы I в моче и криптококковый полисахаридный антиген в СМЖ. Большинство методов обнаружения антигенов основаны на связывании специфического антигена/антитела in vitro и описаны ниже.

Могут использоваться и другие методы, такие как анализ цитотоксичности в культуре ткани для определения токсина С. difficile. При опосредованном токсинами заболевании обнаружение токсина может иметь большее значение, чем идентификация самого микроорганизма (например, токсин С. difficile в кале).

- Молекулярные методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот. В различных методах амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) специфические последовательности микробной ДНК и РНК идентифицируют с использованием праймера нуклеиновой кислоты, который экспоненциально амплифицируется ферментами для создания множества копий целевой нуклеотидной последовательности. Наиболее распространенным МАНК является ПЦР. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ) используется для обнаружения РНК из РНК-содержащих вирусов [например, вирус гепатита С и вирус иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1)].

Применение флуоресцентных меток в реакции позволяет в реальном времени обнаруживать амплифицированную ДНК. Количественная оценка основана на том, что время, необходимое для достижения порога обнаружения, пропорционально начальному количеству копий целевой последовательности нуклеиновой кислоты.

При множественной ПЦР используются несколько пар праймеров для одновременного обнаружения нескольких различных штаммов.

Определение нуклеотидных последовательностей в целевом гене (генах) может использоваться для идентификации конкретных штаммов микроорганизмов, что нередко определяет лечение и/ или прогноз (например, при вирусе гепатита С). Также могут быть обнаружены гены патогенности (например, гены токсинов) или резистентности к противомикробным препаратам; например, ген тесА используют для скрининга на MRSA.

МАНК являются наиболее чувствительными методами прямого обнаружения и позволяют относительно быстро получить результаты. Они широко применяются в вирусологии, где невелика вероятность ложноположительных результатов под влиянием колонизирующих микроорганизмов или контаминации, а также для исследования образцов крови, секрета дыхательных путей, кала и мочи. В бактериологии ПЦР используется для исследования образцов СМЖ, крови, тканей и половых органов, и разрабатывается множественная ПЦР для исследования кала. ПЦР показана для выявления микроорганизмов, которые сложно культивируются (например, Tropheryma whipplei), и все чаще используется в микологии и паразитологии.

б) Микробиологическое исследование. Выявление и последующая характеристика микроорганизмов может осуществляться на основе клинических образцов (например, тканей, мазков и биологических жидкостей).

• Микробиологическое исследование ex vivo (тканевые или клеточные культуры), широко используемое для выделения вирусов, было в значительной степени вытеснено МАНК.

• Микробиологическое исследование in vitro (на искусственных питательных средах) бактерий и грибов применяется для подтверждения наличия патогенов, их идентификации, определения чувствительности к противомикробным препаратам и подтипа микроорганизмов в противоэпидемических целях.

Микробиологические исследования имеют свои ограничения: результаты нельзя получить немедленно, даже для микроорганизмов, которые легко культивируются, а отрицательные результаты микробиологического исследования редко позволяют достоверно исключить инфицирование. Такие микроорганизмы, как Mycobacterium tuberculosis, характеризуются медленным ростом (обычно не менее 2 нед даже в системах ускоренного культивирования). Ряд микроорганизмов, таких как Mycobacterium leprae и Tropheryma whipplei, не могут расти на искусственных средах, а другие (например, Chlamydia spp. и вирусы) растут медленно и только в культурах клеток и тканей, что делает данный процесс достаточно трудоемким.

1. Бактериологическое исследование крови. Терминами «бактериемия» и «фунгемия» описывают присутствие бактерий и грибов в крови. Инфекционное заражение крови — это наличие клинических проявлений бактериемии/фунгемии. Наличие бактериемии/фунгемии можно определить с помощью посева крови на жидкую питательную среду с последующей инкубацией в системе, постоянно отслеживающей рост микроорганизмов (например, с помощью обнаружения продуктов микробного дыхания с использованием флуоресценции) (рис. ниже). При обнаружении роста микроорганизмы идентифицируют и определяют их чувствительность к антибактериальной терапии.

Традиционно идентификацию проводят с помощью окрашивания по Граму и биохимических реакций. Однако в настоящее время для идентификации микроорганизмов все чаще используется MALD1-TOF-MS (см. табл. 2). MALDI-TOF-MS создает профиль белков разных размеров из целевого микроорганизма с использованием баз данных таких профилей для идентификации возбудителя (рис. ниже).

Это быстрый и точный метод. Взятие нескольких образцов крови для микробиологического исследования в разное время позволяет дифференцировать транзиторную (один или два положительных образца) и стойкую (большинство положительных образцов) бактериемию. Это может иметь клиническую значимость при определении источника инфекции.

в) Косвенные методы обнаружения возбудителей. Выявление иммунного (гуморального) ответа организма на проникновение определенного возбудителя позволяет диагностировать инфекцию, вызванную микроорганизмами, которые трудно обнаружить другими методами или которые уже отсутствуют в организме. Термин «серологические исследования» относится к анализам сыворотки крови и включает как обнаружение антигенов (прямое), так и обнаружение антител (непрямое).

1. Обнаружение антител. Для обнаружения специфических для микроорганизма антител, как правило, используются образцы крови (рис. ниже). Результаты обычно выражаются в виде титров антител, то есть величины, обратной максимальному разведению сыворотки, при котором выявляются антитела (например, обнаружение в разведении 1:64 означает титр 64). Сероконверсия означает переход от отрицательного результата к положительному или четырехкратное нарастание титра в образцах сыворотки крови в период выздоровления по сравнению с острым заболеванием.

Забор первого образца обычно производится в течение первой недели заболевания, а контрольный образец берут в период выздоровления — через 2—4 нед. Более ранняя диагностика возможна с помощью обнаружения антител класса IgM, которые вырабатываются на ранних стадиях инфекции.

Ограничение этих тестов заключается в том, что для образования антител необходима полностью интактная иммунная система, поэтому у пациентов с ослабленным иммунитетом могут быть получены ложноотрицательные результаты. Кроме того, за исключением хронических инфекций и обнаружения IgM, выявление антител обычно позволяет поставить диагноз только ретроспективно.

Методы обнаружения антител описаны ниже (методы обнаружения антигенов также описаны в данном разделе, поскольку для них используется сходная методология).

- Иммуноферментный анализ. Принципы иммуноферментного анализа (ИФА, твердофазный ИФА, ELISA) показаны на рис. ниже.

Этот анализ основан на связывании антитела с ферментом, который вызывает изменение цвета при контакте с хромогенным субстратом. Различные конфигурации позволяют обнаруживать антигены или специфические подклассы Ig (например, IgG, IgM, IgA). ИФА также может быть адаптирован для обнаружения продуктов ПЦР с использованием иммобилизованных олигонуклеотидных гибридизационных зондов и различных систем детекции.

- Иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг). В соответствии с молекулярной массой микробные белки разделяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносятся (пятнами, blot) на нитроцеллюлозную мембрану, которую инкубируют с сывороткой крови пациента. Связывание специфических антител выявляется с помощью конъюгата «фермент—антитело-Ig» аналогично ИФА, и специфичность подтверждается его расположением на мембране. Иммуноблоттинг — высокоспецифичный тест, который можно использовать для подтверждения результатов менее специфических тестов, таких как ИФА (например, при болезни Лайма).

- Иммунофлуоресцентные методы диагностики. Непрямой иммунофлуоресцентный анализ (IFAs) выявляет антитела путем инкубации образца сыворотки крови с иммобилизованным антигеном (например, клетки, о которых известно, что они инфицированы вирусом, на предметном стекле); любое вирус-специфическое антитело, присутствующее в сыворотке, связывается с антигеном и затем определяется с использованием Ig человека, меченного флуоресцентной меткой (вторичное антитело). Флуоресценция видна при микроскопии.

Этот метод также помогает обнаруживать микроорганизмы в клинических образцах (обычно в тканях или центрифугированных клетках) с использованием для захвата специфического антитела вместо иммобилизованного антигена.

- Реакция связывания комплемента. В реакции связывания комплемента сыворотку пациента для его инактивации подвергают термической обработке, затем смешивают с тестовым антигеном. Любое специфическое антитело в сыворотке крови будет образовывать комплекс с антигеном. Затем к реакции добавляют комплемент. При наличии комплексов «антиген—антитело» комплемент будет связываться (потребляться). Затем происходит добавление эритроцитов барана, покрытых антиэритроцитарными антителами. Степень лизиса эритроцитов отражает количество оставшегося комплемента и обратно пропорциональна количеству присутствующих комплексов «специфический антиген—антитело».

- Реакции агглютинации. Когда антигены присутствуют на поверхности частиц (например, клеток, частиц латекса или микроорганизмов) и связываются антителами, происходит образование видимых скоплений (или агглютинация).

• При прямой агглютинации сыворотку пациента добавляют к суспензии микроорганизмов, которые экспрессируют исследуемый антиген. Например, в реакции Вейля—Феликса, если сыворотка крови пациента содержит антитела к риккетсиям, они вызывают агглютинацию при добавлении поверхностных (О) антигенов Proteus spp., потому что антитела перекрестно реагируют с антигенами Proteus. Данной реакции не хватает чувствительности и специфичности, но она все еще используется для диагностики риккетсиозной инфекции в условиях ограниченных ресурсов. В реакции Видаля используется суспензия Salmonella typhi и S. paratyphi А и В, обработанная для сохранения только антигенов О и Н.

Эти антигены необходимы для обнаружения соответствующих антител в сыворотке крови пациента с подозрением на брюшной тиф. Реакция не является специфичной, но все еще используется в некоторых частях света.

• При непрямой (пассивной) агглютинации специфический антиген прикрепляется к поверхности частиц-носителей, которые агглютинируют при инкубации с образцами сыворотки крови пациента, содержащими специфические антитела.

• При обратной пассивной агглютинации (обнаружение антигена) частицу-носитель покрывают антителами, а не антигеном.

- Другие исследования. Иммунодиффузия — это миграция антител и антигенов через гели с помощью электрофореза или без него с образованием нерастворимых комплексов в месте их столкновения. Комплексы видны при окрашивании как линии преципитации. Иммунодиффузия используется при диагностике диморфных грибов и некоторых форм аспергиллеза.

Для обнаружения антигена применяется иммунохроматография. Система состоит из пористой тест-полоски (например, из нитроцеллюлозной мембраны), на одном конце которой находится специфическое для мишени антитело, соединенное с цветными микрочастицами. Затем специфическое антитело иммобилизуется в поперечной узкой линии на некотором расстоянии вдоль полоски. Исследуемый материал (например, кровь или мочу) добавляют к комплексам «антитело—частица», которые затем перемещаются вдоль полоски под действием капиллярных сил. Если они образуют комплекс с антигеном, то иммобилизуются специфическим антителом и визуально обнаруживаются в виде поперечной линии на полоске.

При отрицательном тесте комплексы «антитело—частица» связываются с линией иммобилизованных антител к Ig, расположенной дальше вдоль полоски, которая представляет собой отрицательный контроль. Иммунохроматографические тесты являются быстрыми и относительно дешевыми и подходят для тестирования на месте, например, при ВИЧ-1 и малярии.

- Антителонезависимые специфические иммунологические тесты. Анализ высвобождения γ-ИФН (Interferon-Gam-та Release Assay — IGRA) все чаще используется для диагностики латентной туберкулезной инфекции. IGRA не позволяет различить латентную и активную туберкулезную инфекцию и поэтому подходит для использования только в странах с низкой фоновой заболеваемостью ТБ.

г) Определение чувствительности к противомикробным препаратам. Если рост микроорганизма в культуре ингибируется при добавлении противомикробного средства, то данный микроорганизм считается чувствительным к этому противомикробному препарату. Бактериостатические средства вызывают обратимое торможение роста, а бактерицидные препараты приводят к гибели клеток. Для противогрибковых средств эквивалентны термины «фунгистати-ческий/фунгицидный», а для противовирусных препаратов — стимулирующие иммунную систему («вирусостатические») и атакующие вирусы напрямую («вирулицидные»).

Наименьшая концентрация противомикробного средства, при которой ингибируется рост микроорганизма, называется минимальной ингибирующей концентрацией (МИК), а наименьшая концентрация, вызывающая гибель клеток, называется минимальной бактерицидной концентрацией. Если МИК меньше или равна пограничному значению подавления роста, микроорганизм считается чувствительным, а если МИК больше этого значения, то он является резистентным.

Пороговые значения определяются для каждого противомикробного средства на основании совокупности фармакокинетических и клинических данных. Взаимосвязь между чувствительностью к противомикробным препаратам in vitro и клиническим эффектом является сложной и также зависит от иммунного статуса, фармакокинетической изменчивости, сопутствующих заболеваний, которые могут влиять на фармакокинетику или фармакодинамику, дозировки антибиотиков, а также МИК/ минимальной бактерицидной концентрации. Таким образом, лечение пациента в соответствии с результатами определения чувствительности к противомикробным препаратам повышает вероятность выздоровления, но не гарантирует терапевтического успеха.

Определение чувствительности часто проводится диско-диффузионным методом (рис. ниже). Диски фильтровальной бумаги, пропитанные антибиотиками, помещают на чашки с агаром, содержащие бактерии; антибиотик диффундирует в агар, что приводит к формированию градиента его концентрации в направлении от диска. Бактерии не могут расти там, где концентрация антибиотика превышает МИК, которая может быть рассчитана по размеру зоны ингибирования. МИК обычно измеряется в диагностических лабораториях с использованием диффузионных полосок.

- Также рекомендуем "Эпидемиология инфекционных болезней - кратко с точки зрения внутренних болезней"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 17.11.2023