Широко распространенные детские заболевания обычно имеют мультифакторную этиологию. Сочетание множества генов и факторов окружающей среды дает начало цепочке событий, непосредственно ведущей к болезни. Комплексность сочетания факторов, способствующих развитию болезни, усложняет поиск генетических вариантов, вызывающих заболевание. Генетическими инструментами являются завершенная последовательность генома человека, общедоступные базы данных генетических вариантов и карта гаплотипов человека.
В дополнение к общедоступным генетическим базам данных резкое снижение стоимости генотипирования и секвенирования ДНК позволило эффективно протестировать очень большое количество генетических вариантов на большом количестве пациентов. Основная часть этих исследований сосредоточена на наиболее распространенных вариантах (с частотой >5%). Технологии секвенирования ДНК обеспечивают низкую стоимость полноэкзомного секвенирования и, соответственно, его широкое использование. Эта технология используется для исследования роли редких вариантов кодирующей последовательности в этиологии широко распространенных заболеваний.
Включение генетических инструментов в крупные, хорошо спланированные популяционные исследования относится к области генетической эпидемиологии. Было разработано много новых методов анализа генетических данных, что стимулировало возрождение прикладной популяционной генетики.
Миллионы генетических вариантов м.б. обнаружены у каждого человека. Многие из этих вариантов не оказывают никакого влияния на его здоровье, влияние других, наоборот, достаточно ощутимо. Иногда моногенные мутации устойчиво вызывают такие заболевания, как муковисцидоз и СКА, в то время как др. типы генетической изменчивости гораздо меньше способствуют возникновению специфических заболеваний, поэтому их лучше всего рассматривать как модификаторы риска. На рис. 1 представлена взаимосвязь между частотой обнаружения вариантов и относительным, клинически значимым влиянием аллеля.
Рисунок 1. Соотношение между частотой обнаружения аллелей и относительной силой генетического эффекта. Аллели с большим эффектом, как правило, очень редки, но м.б. изучены с помощью небольшой выборки из-за относительной легкости обнаружения аллелей при их высокой клинической значимости. Частые варианты, как правило, оказывают умеренное или слабое влияние на здоровье, требуя больших наборов данных для визуализации статистически небольших эффектов. Подавляющее большинство аллелей, приводящих к заболеваниям и идентифицированных на сегодняшний день, имеют характеристики, обозначенные в диагональных пунктирных линиях. GWA — общегеномные ассоциативные исследования
Диапазон влияния вариантов логарифмический и может варьировать от слегка повышенного риска возникновения заболевания до предопределенного, клинически манифестного заболевания. Исследования, сосредоточенные на обнаружении редких мутаций, имеющих огромные последствия для здоровья, требуют участия лишь небольших групп населения для достижения статистической значимости, в то время как исследования частых вариантов, из-за слабого ожидаемого влияния каждого варианта, нуждаются в привлечении гораздо более многочисленных групп.
Кумулятивный риск многих часто обнаруживаемых вариантов определяет генетическую предрасположенность. Что касается широко распространенных заболеваний, одной только генетической предрасположенности недостаточно, чтобы стать причиной болезни. Каждый из нас наследует разную степень предрасположенности к болезням, которая затем возрастает под воздействием определенных факторов окружающей среды. На рис. 2 показана модель влияния частых генетических вариантов на здоровье человека. Одна из целей мед. генетики состоит в том, чтобы идентифицировать гены, определяющие исходную генетическую предрасположенность, и помочь предотвратить возникновение болезни, либо избегая вредного влияния факторов окружающей среды, либо вводя меры по снижению риска.
Рисунок 2. Модель влияния взаимодействия генов и окружающей среды на генетическую предрасположенность к наиболее часто встречающимся заболеваниям. Каждый из нас наследует частые варианты, которые определяют исходную генетическую предрасположенность к возникновению заболевания. Для мультифакторных заболеваний исходная генетическая предрасположенность сама по себе недостаточна, чтобы вызвать болезнь. Со временем воздействие факторов окружающей среды увеличивает вероятность развития заболевания. Выявление вариантов генов, усугубляющих риск, может помочь в разработке стратегий профилактики или лечения
Для людей, уже пораженных заболеванием, важно лучше понять его патогенез в надежде, что это поможет подобрать наиболее эффективные методы лечения. Частые генетические вариации также могут влиять на реакцию организма на ЛС, увеличивать риск развития побочных эффектов, а также усиливать действие токсинов, поступающих из окружающей среды. Генетически сложные детерминированные признаки по своей сути достаточно трудно изучить, если точность клинического диагноза (фенотипа) предположительная, как это часто бывает с нейроповеденческими признаками. Отправной точкой генетического анализа сложного признака является получение доказательств в поддержку генетического вклада и определение относительной силы генетических факторов и факторов окружающей среды.
Генетически сложные признаки обычно демонстрируют семейную кластеризацию, но не передаются по регулярному образцу, как при АуД- или АуР-наследовании. Сложные признаки часто обнаруживают вариации среди разных этнических или расовых групп, возможно, отражая различия в вариантах генов между этими группами.
Анализ потенциального генетического вклада начинается с определения того, встречается ли признак у родственных индивидов чаще, чем среди населения в целом. Основным показателем семейной принадлежности является относительный риск первой степени (обычно обозначаемый символом X), который равен отношению коэффициента распространенности среди кровных братьев и сестер и/или родителей к коэффициенту распространенности среди населения в целом. Значение λs для СД-1 ~15. Относительную силу генетических и негенетических факторов риска можно определить с помощью анализа изменения компонентов. Наследуемость признака — это определение доли общей изменчивости, обусловленной генетическими факторами (рис. 3).
Рисунок 3. Концепция наследуемости. Фенотипическая дисперсия определенного признака может быть разделена на вклад генетической изменчивости, изменчивости окружающей среды и изменчивости измерения. Обычно это определяется эмпирически. Наследуемость — это доля фенотипической изменчивости, обусловленная генетической изменчивостью. Наследуемость можно определить по корреляции количественного признака между родственниками
Некоторые широко распространенные заболевания, такие как СД, м.б. вызваны моногенными мутациями (менделевское наследование), хромосомными и др. геномными нарушениями. Эти менее распространенные причины заболевания часто могут дать важную информацию о наиболее значимых вовлеченных молекулярных путях. Хромосомные области с генами, потенциально обусловливающими восприимчивость к болезням, теоретически м.б. обнаружены с помощью картирования сцепления, способного обнаруживать области ДНК, наследуемые в семьях с конкретным заболеванием. Однако их реализация на практике оказывается довольно трудной для большинства сложных признаков либо из-за недостатка семейств, либо из-за слабого влияния отдельных генетических локусов.
Генетические ассоциативные исследования более эффективны для выявления распространенных вариантов генов (>5% в популяции), связанных с повышенным риском заболевания, но они не эффективны, если варианты генов, вызывающих заболевание, относительно редки. Обнаружение умеренного эффекта каждого варианта и взаимодействия с факторами окружающей среды требует хорошо обоснованных исследований, которые часто включают тысячи людей.
Был также разработан ряд параллельных подходов к анализу совокупных эффектов редких вариантов генов. Такие методы ассоциативных исследований редких вариантов, по-видимому, также требуют больших размеров выборки, потому что эффекты генов оказались относительно слабыми.
Для картирования сцеплений и исследований ассоциаций требуются маркеры вдоль ДНК, которые можно установить или генотипировать с помощью крупномасштабных лабораторных методов с высокой производительностью. Обычно используемые маркеры имеют форму микросателлитов и однонуклеотидных полиморфизмов (рис. 4). Образцы одного и того же участка генома, забранные у 50 человек, покажут, что 1:200 оснований отличается от более распространенной формы. Хотя большинство однонуклеотидных полиморфизмов не имеет какой-либо очевидной функции, существуют такие, которые изменяют аминокислотную последовательность белка или влияют на регуляцию экспрессии генов. Некоторые из этих функциональных изменений напрямую влияют на восприимчивость к болезням.
Рисунок 4. У разных людей обнаружены разные комбинации однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП). Расположение этих ОНП можно точно определить на генетических картах человека. Впоследствии их можно использовать для создания профилей, ассоциируемых с различиями фармакологического ответа (их эффективность или неэффективность)
Сложный клинический фенотип можно определить по наличию или отсутствию заболевания как дихотомического признака или путем выбора клинически значимой переменной, такой как сывороточная глюкоза при СД-2, которая является непрерывным или количественным признаком.
Несмотря на то что заблаговременное определение подгруппы пациентов на основании общих механизмов заболевания может оказаться невозможным, чем более единообразен фенотип, тем больше вероятность успешного завершения генетического исследования. Гетерогенность локуса возникает, когда признак является результатом независимого действия >2 генов. Аллельная гетерогенность означает, что присутствие >2 вариантов в определенном гене может обусловливать повышенный риск возникновения заболевания. В случае развития признака или заболевания по негенетическому механизму возникает фенокопия. Эти три фактора часто усложняют идентификацию отдельных генов восприимчивости к болезням, поскольку они уменьшают эффективный размер исследуемой группы.
Человек, несущий какой-либо вариант или аллель (унаследованную единицу, сегмент ДНК или хромосому) в гене, имеет определенную вероятность быть пораженным заболеванием, обусловленным специфическим генным вариантом. Этот феномен получил название пенетрантность. Некоторые заболевания проявляют симптомы только в более позднем возрасте (возрастная пенетрантность), что может привести к ошибочной классификации детей, имеющих ген заболевания, как ЗЛ. Моногенные заболевания обычно возникают в результате мутаций с относительно высокой пенетрантностью, но некоторые частые генетические варианты имеют очень низкую пенетрантность, поскольку их общая роль в развитии заболевания невелика. Многие из таких распространенных вариантов могут способствовать повышению риска возникновения заболевания для сложного признака. Нормальный рост человека обусловливают >400 генов.
В идеале важнейшие воздействия окружающей среды должны быть выявлены и учтены в ходе популяционных исследований, поскольку может существовать зависимость между фактором окружающей среды и определенным генетическим вариантом. Примером является вероятность перенесенной вирусной инфекции, предшествующей возникновению СД-1. Хотя есть серьезные основания полагать, что взаимодействие генов с окружающей средой играет важную роль в этиологии наиболее распространенных заболеваний, их сложно идентифицировать и измерить.
Достаточно крупные исследования с постоянным сбором информации о воздействии окружающей среды проводятся очень редко. Такие методы, как полногеномный анализ метилирования ДНК, могут предоставить доказательства воздействия факторов окружающей среды — так называемое программирование развития. Эта информация м.б. использована для обнаружения и проверки взаимодействия генов с окружающей средой.
а) Анализ сцепления. В прошлом исследования сцепления применялись для выделения генов, обусловливающих редкие генетические синдромы; модифицированные методы использовались для идентификации хромосомных участков, связанных с более распространенными заболеваниями. Исследования сцепления подразумевают маркировку сегментов генома человека маркерами, которые позволяют идентифицировать сегменты, унаследованные от семьи вместе с болезнью. Маркеры, как правило, представляют собой микросателлиты или однонуклеотидные полиморфизмы, которые определяют и помогают различить, какой тип аллеля несет любой человек. Под генотипом понимают комбинации аллелей в локусе диплоидного организма. Анализ взаимосвязи наиболее распространенных заболеваний дал противоречивые результаты.
Такие факторы, как гетерогенность, плейотропия, переменная экспрессивность и сниженная пенетрантность, в дополнение к изменчивости воздействия окружающей среды, ослабляют значимость исследований сцепления сложных признаков.
б) Генетическая ассоциация. В случае наиболее распространенных многофакторных заболеваний анализ ассоциаций может использоваться для выявления причинно-значимых генов. Существует два типа анализа ассоциаций: прямая ассоциация, когда тестируется сам причинный вариант, чтобы увидеть, коррелирует ли его присутствие с заболеванием, и косвенная ассоциация, когда в качестве заместителей используются маркеры, физически близкие к биологически значимому варианту. Корреляция маркеров с др. генетическими вариантами в небольшом участке генома называется неравновесием по сцеплению. Реализация косвенной ассоциации стала возможной благодаря созданию подробной генетической карты в трех контрольных этнических группах (европейской, азиатской, западноафриканской) в рамках международного проекта НарМар. Были идентифицированы однонуклеотидные полиморфизмы, способные маркировать большую часть генома, их можно генотипировать по низкой себестоимости с использованием специально разработанных микрочипов.
Для анализа ассоциаций используются три основных типа исследований. В исследовании «случай-контроль» частота аллеля в затронутой группе сравнивается с незатронутой группой. В исследовании, основанном на семейном контроле, родители, кровные братья и сестры пораженного заболеванием человека используются в качестве контрольных параметров. При исследовании когортного типа проводится мед. сопровождение большого количества лиц с целью отслеживания начала любого числа заболеваний. Когортный анализ очень дорог, а настоящие когортные исследования редки.
Тип семейных контрольных исследований в некоторой степени привлекателен для изучения детских болезней, поскольку обычно к ним можно подключить родителей. Эти исследования решают серьезную проблему при ассоциативном тестировании, потому что родители идеально подходят для генетического фона. Когда отобраны родители, статистический тест, используемый для этих исследований, называется тестом на нарушение равновесия передачи. Он служит для сравнения переданного генотипа с непередаваемым предполагаемым генотипом. Успех всего анализа ассоциаций зависит от хорошо продуманного плана исследования и точно измеренного признака, чтобы избежать ошибочной классификации фенотипа. В крупных популяционных исследованиях смешение по этнической принадлежности или стратификации населения может исказить результаты. Некоторые генетические варианты чаще встречаются у лиц из определенной этнической группы, что может вызывать очевидную ассоциацию варианта с заболеванием, если уровень заболеваемости в этой группе выше.
Эта ассоциация не была бы истинной ассоциацией между аллелем и болезнью, потому что была бы искажена генетическим фоном. Семейные тесты с использованием теста на нарушение равновесия передачи не восприимчивы к стратификации населения. Однако данный тест и связанные с ним исследования по своей сути менее эффективны, чем исследования типа «случай-контроль». Новейшие методы определения малейшего несоответствия между случаями и контролем с применением многих тысяч маркеров, обычно генотипируемых в исследованиях общегеномных ассоциаций, позволяют исследователям учитывать этот эффект.
Анализы ассоциаций должны стать мощным инструментом для поиска генетических вариаций, представляющих риск для человека; вклад какого-либо одного генетического варианта в сложный механизм заболевания будет очень малым. Были обнаружены генетические варианты, способные вовлекать в процесс новый ген, что мотивирует более глубокое исследование механизмов, влияющих на исход болезни. Такие ассоциации, как аллель АРОЕε4, обусловливающий повышенный риск возникновения болезни Альцгеймера, отмечены многими исследованиями. Многие опубликованные результаты ассоциативных исследований не воспроизводятся; недостаточная значимость и стратификация могут объяснить несоответствия. По состоянию на конец 2016 г. было каталогизировано 2650 исследований и 29 954 ассоциации уникальных признаков однонуклеотидных полиморфизмов.
Малозатратные методы полноэкзомного и полногеномного секвенирования индивидуумов позволят провести более полную оценку всего диапазона генетических вариантов, связанных с наиболее распространенными заболеваниями. Редкие генетические варианты, напр. небольшие инсерции или делеции, могут оказаться чрезвычайно важными для объяснения влияния генетических факторов на возникновение важных детских болезней, таких как РАС, ВПС и др. врожденные дефекты. Редкие генетические варианты также могут влиять на общие нарушения, такие как ожирение, СД и аутоиммунные заболевания. Известно, что при распространенных тяжелых расстройствах, таких как умственная отсталость и ВПС, важную роль играют мутации de novo (т.е. мутации, не присутствующие ни у одного из родителей).
