Редкие и новые заболевания часто проявляются в детстве и представляют собой диагностическую проблему, которую можно решить с помощью передовых генетических технологий. В США к категории редких болезней относятся расстройства, от которых страдают <200 000 человек (1:1500 человек), однако единого определения на международном уровне согласовано не было.
а) Сфера генетических заболеваний. На сегодняшний день выявлено ок. 8000 редких заболеваний, а существование 23 000 генов в геноме человека позволяет предположить, что в будущем генетических заболеваний будет обнаружено гораздо больше. Причины, по которым заболевания у пациентов могут оставаться недиагностированными, несмотря на обширное предварительное обследование, м.б. следующими.
• Связь генетического варианта с фенотипом заболевания ранее не была установлена.
• Наличие генетической плейотропии (тот же ген, но др. вариант, дающий иной фенотип).
• Наличие генетической гетерогенности (разные гены производят сходный фенотип).
• Болезнь известна, но известное заболевание может иметь нетипичные проявления.
• Совокупность разных заболеваний влияет на симптоматику болезни.
• Соматический мозаицизм.
1. Программа по недиагностированным заболеваниям Национального института здравоохранения Соединенных Штатов Америки. Одна из попыток исследования недиагностированных заболеваний была предпринята в рамках Программы по недиагностированным заболеваниям, учрежденной Национальным институтом 30 США, которая была расширена до общенациональной сети по недиагностированным заболеваниям. В рамках данной программы было обработано >4000 заявок от пациентов, которые сопровождались результатами предыдущих исследований, изложенных лечащим врачом в сводной форме и подтвержденных выписками из ЭМК, включая фото-и видеоматериалы, гистологические слайды биопсийного материала.
Специализированные консультанты просматривают записи, а управляющие программой определяют план дальнейших действий. Допущенные пациенты направляются в Клинический центр Национального института 30 на недельную госпитализацию. Примерно 1/2 пациентов с недиагностированными заболеваниями имеют неврологические расстройства; также многие из них страдают ССЗ, ревматологическими, иммунологическими и легочными заболеваниями. Примерно 40% принятых пациентов — дети, часто с врожденными аномалиями и неврологическими нарушениями.
б) Клиническая оценка. Пациенты могут оставаться без окончательного диагноза после всестороннего обследования в т.ч. и потому, что каждый человек имеет уникальный генетический фон и подвергается влиянию разл. факторов окружающей среды, а болезни имеют разл. проявление. Понятие «недиагностированные заболевания» включает в себя ранее не наблюдаемые заболевания, необычные проявления обычно распознаваемых болезней и сочетания заболеваний, которые взаимно затрудняют диагностику. Тщательное клиническое обследование позволяет клиницисту расширить ДД за счет исследований, консультаций и клинических анализов.
Всестороннее исследование фенотипа, лучевая диагностика и прочие тесты обеспечивают лучшее документирование проявлений, а также позволяют соотнести их с еще не обнаруженными заболеваниями, генетическими вариантами и когортами пациентов. Полный анамнез фиксирует данные, включая находки в пренатальный и неонатальный период, информацию об этапах развития, характере роста, начале и прогрессировании симптомов и признаков, вызывающих их воздействиях, реакциях на ЛС и родословную, чтобы идентифицировать др. членов семьи, возможно пораженных заболеванием.
Соответствующие физические данные включают дисморфизм, органомегалию, неврологические нарушения, костные патологии и дерматологические проявления. Поскольку многие редкие и новые заболевания являются мультисистемными, профильные консультанты играют решающую роль в каждой диагностической оценке. Наиболее часто проводимые диагностические исследования перечислены в табл. 1; нейроразвитие или нейродегенеративные фенотипы требуют проведения еще более широких исследований (табл. 2).
Госпитализация обеспечивает тесное взаимодействие между экспертами в разных областях, облегчает сбор информации для диагностики сложных случаев и часто приводит к открытию новых болезней. В последнем случае обследование показано и др. членам семьи с целью выяснения, поражены ли они этим заболеванием.
1. Генетические исследования на коммерческой основе. После завершения фенотипического обследования можно составить список возможных генетических заболеваний. Лабораторные исследования доступны для выявления все большего числа молекулярных нарушений. Примерами генетических панелей являются панели для Х-сцепленных когнитивных нарушений, наследственной спастической параплегии, спастической параплегии и нарушений походки, спиноцеребеллярной атаксии, дистонии и митохондриальных нарушений. Некоторые из них дорогостоящи и м.б. дороже секвенирования экзома.
С др. стороны, экзомное и геномное секвенирования неэффективны для выявления заболеваний, обусловленных многими типами генетических нарушений, в т.ч. повторяющихся последовательностей ДНК. Кроме того, секвенирование экзома м.б. менее достоверным при исключении генетических заболеваний, чем специальные тестовые панели.
в) Матрицы однонуклеотидных полиморфизмов. Матрицы однонуклеотидных полиморфизмов и секвенирование следующего поколения способны предоставить ценную информацию о структуре всего генома. Из 3,2 млрд пар оснований человеческого генома многие являются полиморфными, обычно определяемыми как различающиеся между любыми двумя людьми в >1% случаев. В большинстве групп населения существует ок. 4 млн различий между любыми двумя неродственными лицами (в среднем ок. 1:1000 оснований в геноме). В пределах одной этнической группы ~1 общий однонуклеотидный полиморфизм приходится на 3000-7000 пар оснований, где общий означает вероятность (>10%) отличия пары оснований у двух неродственных людей.
Приблизительно 1 млн из этих общих однонуклеотидных полиморфизмов можно включить в матрицу гибридизации ДНК и исследовать одновременно с целью выявления вариантов числа копий, мозаицизма и одинаковых по происхождению участков.
Эти данные дополняют результаты секвенирования следующего поколения; одним из примеров является спаривание вариантов последовательности, обнаруженных с помощью экзомного или геномного секвенирования, с транс-ориентированными делециями, обнаруженными с помощью анализа однонуклеотидных полиморфизмов.
г) Секвенирование экзома. Технические достижения позволили осуществить массовое и недорогое секвенирование ДНК, сделав возможным определение последовательности кодирующих областей почти всех генов человека. Поскольку это составляет 1,9% от 3,2 млрд нуклеотидов генома человека, последовательности экзома составляют ~60 млн нуклеотидов. Используя современные технологии, клиническое секвенирование экзома адекватно секвенирует >80% известных генов и >90% генов, ассоциируемых с заболеваниями человека.
В среднем секвенирование экзома выявляет ок. 35 000 нуклеотидов (0,06%), которые отличаются от «эталонной» и любой др. последовательности неродственного человека из той же этнической группы. В это число входят и некоторые лабораторные и компьютерные ошибки. На практике большинство вариантов представляют собой несущественные полиморфизмы и минорные поли-нуклеотидные повторы, которые обнаруживаются на границах интрона или экзона. Каждый из 35 000 вариантов неизвестной клинической значимости м.б. потенциально патогенным, но только один (два в случае компаунд-гете-розигот) является вызывающей заболевание мутацией для моногенного заболевания (возможно, с двумя или тремя дополнительными локусами, модифицирующими степень тяжести).
Клиницист и биоинформатик должны сократить количество вариантов-кандидатов до приемлемого числа, что является сложной задачей.
Напр., вариант, вызывающий заболевание с началом во взрослом возрасте, может выглядеть так же «разрушительно», как и др. вариант, вызывающий врожденное заболевание. Однако вероятность наличия сопутствующих заболеваний у взрослого и ребенка сильно отличается.
Определенные правила используются для ДД потенциально важных и незначимых вариантов. Напр., варианты, которые сегрегируются в семье в соответствии с данной моделью наследования (напр., доминантный или рецессивный), сохраняются, в то время как сегрегирующиеся случайным образом отбрасываются. Этот фильтр сегрегации требует тщательного сбора клинических данных и планирования эксперимента, т.к. он зависит от корректного выбора затронутых и незатронутых статусов в семье и сбора данных секвенирования для членов семьи, помимо пробанда.
Второй метод, используемый для анализа вариантов последовательностей, — это оценка патогенности. Специалисты по биоинформатике определяют вероятность того, что данный вариант последовательности ДНК будет иметь биологические последствия (напр., изменение функции белка или экспрессии генов). Такие факторы, как сохранение нуклеотидов и различия в кодированных аминокислотах, используются для оценки патогенности или определения ее пределов. Разл. программы предпринимают разные, часто параллельные подходы. PolyPhen-2, SIFT и MutationTaster оценивают патогенность аминокислотных изменений.
Такие программы компьютерного моделирования, как CADD, Eigen и М-САР, обученные на уже подтвержденных модельных генетических изменениях, прогнозируют влияние на экспрессию генов некодирующих вариантов.
Эти фильтры очень эффективны в связи с общедоступностью обширных баз данных о населении, в т.ч. проект «1000 геномов», консорциум агрегации экзома и британский проект генома «10К». В последующие 1-2 года базы данных с популяциями генома в диапазоне 100 тыс.-1 млн (напр., база данных GnomAD) улучшат эти фильтры и обеспечат более высокую частоту субпопуляции. В конечном счете мультиэтническая выверка на основе теории графов должна позволить успешную фильтрацию вариантов в незаконченных в настоящее время областях генома, таких как область HLA. В целом компьютерная оценка патогенности дает л/п- и л/о-результаты в диапазоне 10-20%.
Некоторые фильтры сравнивают варианты с базами данных, содержащих ранее установленные или оцененные варианты, обнаруженные в разл. популяциях, такие как информация о популяционной частоте (ЕхАС) или содержащие доказанные ассоциации вариантов с заболеванием человека (CLINVAR). Последняя, наиболее потенциально полезная, пока является неполной для многих генов, но постоянно совершенствуется. Одна из распространенных ошибок фильтров баз данных — неточное определение некоторых вариантов как редких. Обычно это происходит, когда в базе данных отсутствует информация о популяциях, в которых вариант встречается чаще, чем в популяциях, включенных в базу.
При использовании полногеномного секвенирования для клинической диагностики необходимо учитывать несколько моментов. Положительная прогностическая ценность обеспечивает вероятность того, что «+» тест будет истинно «+». Вероятность выше для тех популяций, в которых заболевание встречается чаще, и ниже в тех, для которых заболевание является редким. Человек, проходящий тестирование методом секвенирования экзома, не проявит никаких клинических признаков или симптомов большинства генетических заболеваний, на которые проводится секвенирование экзома. Следовательно, многие явно «+» результаты будут л/п-вариантами, связанными с фенотипами, которых нет у тестируемого человека.
Индивидуальные исследования в сравнении с семейными являются вполне релевантными, потому что семейные данные позволяют существенно отфильтровать варианты для пробанда. Это преимущество необходимо сопоставлять с финансовыми затратами на обследование семей в сравнении с затратами на отдельных людей. Более того, семейные исследования бесполезны, если имеющего заболевание человека считают ЗЛ, или наоборот. Следовательно, фенотипирование членов семьи имеет решающее значение. В случае заболеваний с поздним началом младшие кровные братья и сестры могут не подходить для включения в исследование секвенирования экзома, поскольку достоверно установленный диагноз у них отсутствует.
Базы данных с участием большого количества молодых людей могут иметь множество патологических вариантов, которые вызывают болезни у пожилых людей и не подходят ни для фильтрации вариантов в случаях заболеваний с поздним началом у взрослых, ни для пренатального консультирования о рисках наследования заболеваний с поздним началом.
Должна осуществляться политика пересмотра данных. Секвенирование в масштабе генома позволяет получить данные для многих генов, помимо тех, которые используются в настоящее время в диагностике; эти данные м.б. полезны для лечения пациента в будущем.
Некоторые незарегистрированные генные мутации, которые в настоящее время не ассоциируют с заболеванием, м.б. задействованы в будущем как факторы риска возникновения заболевания или даже как защитные факторы. В текущих условиях тестирования все чаще устанавливаются временные ограничения повторного использования данных, а также плата за хранение и повторное использование. Фактически хранение данных сейчас становится дороже, чем стоимость их повторного создания.
Предварительное обсуждение со специалистом-генетиком принципиально важно. Перед отправкой на секвенирование экзома следует обратиться за генетической консультацией. Получение информированного согласия на секвенирование экзома — сложный процесс, включающий обсуждение факторов риска заболевания, возможности выявления носительства не связанных с ним мутаций и предрасположенности к онкологическим заболеваниям. Лиц, давших согласие, следует спросить, о каких результатах они хотели бы быть проинформированы.
Прогнозирование результатов, которые трудно использовать в клинической практике, является важной частью консультирования. Варианты неизвестной значимости являются проблематичными, а секвенирование в масштабе генома усугубляет проблему, включая переменное количество результатов, которые трудно использовать для принятия мед. решений. Обсудить такие варианты с семьями м.б. непросто; консультирование семей о вероятности получения такого результата до проведения тестирования может помочь семье справиться с ситуацией после прихода заключения.
При использовании в качестве генной панели секвенирование экзома является решающим, но не окончательным. Исследование экзома — это экономичный способ одновременного тестирования множества генов, но покрытие некоторых экзонов варьирует. Следовательно, исследования экзома не всегда могут исключить варианты в панели генов. С помощью тщательного анализа, включающего лабораторную валидацию, выполняемую аналогичным образом у многих пациентов, можно оценить покрытие экзома любого данного гена. Однако частные или клинические центры тестирования могут отказать в проведении анализа, требующего изучения большого набора генов.
Т.о., панель генов м.б. полезна, когда предсказательный индекс высок в отношении расстройства, вызванного большой группой генов. Примерами могут служить мозжечковая атаксия и наследственная спастическая параплегия.
Предоставление информации центру тестирования увеличивает шансы на диагностику. Интерпретация секвенирования экзома существенно выигрывает при включении точного и подробного фенотипа. Чем больше клинической информации предоставлено лаборатории, тем более точным и полезным будет клиническое заключение.
Роль полногеномного секвенирования в клинической практике еще не определена, но является предметом рассмотрения, когда секвенирование экзома не позволяет поставить диагноз. Основной вопрос заключается в том, могут ли находки вариантов неизвестной клинической значимости в экзоме иметь большую значимость, чем любые дополнительные варианты, обнаруженные методом полногеномного секвенирования, либо предпочтительнее клиническое заключение об отсутствии врожденной генетической или молекулярной причины у недиагностированного пациента. Инструменты полногеномного секвенирования пользуются меньшим доверием из-за более низкого сетевого охвата, помимо этого, они требуют больше времени для обработки и генерируют варианты в некодирующих областях генома, которые гораздо труднее фильтровать и интерпретировать.
д) Исследование генных функций. Несмотря на фильтрацию по частоте и прогнозируемой патогенности, вариант, идентифицированный с помощью экзомного или геномного секвенирования, нельзя интерпретировать как причину заболевания пациента, если ранее не было доказано, что он вызывает заболевание у др. пациента с аналогичным фенотипом. Чтобы доказать причинно-следственную связь, мед. генетика полагается на ассоциации (повторение мутаций в гене среди лиц со сходным фенотипом). В случае редких заболеваний пораженных пациентов м.б. недостаточно, чтобы обозначить статистически значимую ассоциацию, поэтому могут потребоваться др. данные из онтологий фенотипов, метаболомики, гликомики, протеомики и липидомики.
Кроме того, для воспроизведения болезни можно разработать модели (мышей, рыбок данио, плодовых мушек, дрожжей, культивированных кл.).
Изучаемый вариант также м.б. вызван биологическим процессом или механизмом, результатом нарушения которого, как известно, является аналогичный фенотип. Наконец, стандартизованные и коррелированные фенотипические и геномные данные помещаются в базу данных для идентификации др. лиц со схожим фенотипом и мутациями в том же гене.
Врачи могут иметь свои предубеждения к группе вариантов, возможно являющихся причиной болезней, но часто это заблуждение. В данном случае предпочтителен стандартизированный компьютерный подход. Напр., онтология человеческого фенотипа стандартизирует описание заболевания и, поскольку дескрипторы были картированы для др. заболеваний человека и для мутантных модельных организмов, идентифицирует возможные гены-кандидаты и генетические сети, ответственные за возникновение болезни. Точно так же нецелевые лабораторные скрининговые тесты обеспечивают беспристрастный обзор клеточной биологии, физиологии пациента и более информированную приоритизацию вариантов-кандидатов.
Окончательным доказательством причинной связи является облегчение течения болезни путем исправления генетического дефекта; это м.б. продемонстрировано на модельной системе, которая воспроизводит человеческое заболевание. Альтернативный поиск др. пациентов со схожим фенотипом и мутациями в том же гене может выполняться с использованием общедоступных баз данных, созданных в строгом соответствии со статистическими и биологическими стандартами.
е) Проблемы педиатрии. Из первых 500 педиатрических заявок, рассмотренных в рамках программы недиагностированных болезней, >10% указывали на наличие аналогичного заболевания у более одного члена семьи (обычно у кровного родственника). Пики кривых возрастного распределения приходились на 4-5 лет (отображая пациентов с врожденными заболеваниями) и на 16-18 лет (отображая заболевания с проявлением симптомов в раннем школьном возрасте). Большинство соискателей находилось в диагностической «одиссее» >5 лет. Из 200 принятых детей 25% был установлен диагноз; в 1/2 случаев с использованием обычных диагностических методов, включая клиническое подозрение, биохимический анализ с молекулярным подтверждением или рентгенографическую интерпретацию.
В остальных случаях (все связаны с редкими заболеваниями) для подтверждения диагноза использовались тесты однонуклеотидного полиморфизма и секвенирования следующего поколения.
При ведении записей в ЭМК ребенка следует обратить внимание на внесение полной информации о том, что было и что не было выполнено ранее. ЭМК — важный инструмент, но функции «скопировать» и «переслать» могут закрепить ошибки, такие как нормальные результаты тестирования, когда на самом деле тест был рекомендован или назначен, но не выполнен. Серийное копирование также способствует потере навыков критического мышления, неспособности собрать адекватный анамнез и уловить нюансы развития симптомов. Анамнез и физикальное обследование должны быть собраны заново, а все предыдущие результаты анализов подтверждены копиями с оригиналов лабораторных заключений.
Длительные и болезненные процедуры должны выполняться под седацией, но риски, связанные с седацией, должны быть сопоставлены с ценностью информации и полученных образцов.
1. Рекомендации для семей с недиагностированными заболеваниями у детей. Когда ребенок приходит на обследование в генетическую клинику, родители задают следующие вопросы.
• Что у моего ребенка (диагноз)?
• Почему это с ним произошло (этиология/наследова-ние)?
• Что произойдет в будущем (течение заболевания, прогноз)?
• Существует ли лечение (терапия)?
• Может ли то же самое случиться с др. членами семьи (повторный риск)?
Ответ на любой из этих вопросов требует точного диагноза. Отсутствие диагноза вызывает дискомфорт как у семьи, так и у врача, порождает подозрение у родственников и знакомых и вызывает чувство вины за то, что они не приложили достаточно усилий, чтобы получить диагноз. Семьи часто обращаются все к большему количеству специалистов, разочаровавшись отсутствием координации между поставщиками мед. услуг. Семьи должны сохранять копии результатов каждого теста и заключений каждого специалиста в папке для визита в др. МО.
Изложенное на 2-3 страницах краткое описание истории болезни ребенка, принимаемых им ЛС, списка поставщиков мед. услуг с контактной информацией, основных мед. задач, уровня самочувствия в дни ремиссий и болезни, а также терапевтических вмешательств, которые имели эффект в прошлом, могут иметь огромную ценность в условиях ОНМП. ЭМК легко обновляется.
Родители всегда м.б. лучшими защитниками своего ребенка, особенно ребенка с недиагностированным заболеванием. Рекомендации родителям ребенка с недиагностированным заболеванием схожи с рекомендациями для любого ребенка с хроническим заболеванием.
• Подшивайте копии всех записей, особенно оригиналы лабораторных заключений из общей «рассылки».
• Носите с собой обновленный перечень указаний о действиях, которые должны быть предприняты в экстренном случае.
• Установите постоянную связь с ориентированной на пациента МО, даже если вы получите много сторонних мнений.
• Найдите физиотерапевта (врача реабилитационной медицины) для координации реабилитационной МП.
• Настойчиво добивайтесь оказания необходимых услуг в школьной системе (см. главу 48), при необходимости используя адвоката.
• Изучите группы поддержки родителей при неизвестных заболеваниях («Синдромы без имени», Национальная организация по редким заболеваниям).
• Периодически спрашивайте у медработников (особенно генетиков) о новых диагнозах, о которых сообщается в мед. литературе.
• Выделите время для себя, подключив для ухода за пациентом членов семьи или специалистов временного ухода.
• Работайте над оказанием поддержки и внимания здоровым детям в семье.
• Что касается умирающего ребенка, оцените необходимость вскрытия трупа для установления диагноза, особенно если есть вероятность будущей беременности.
ж) Диагностический спектр. Редкие и новые генетические нарушения могут манифестировать в любом возрасте; «тяжелые» мутации гена могут проявиться в раннем возрасте, а «легкие» мутации — позже. Диагностика известных заболеваний может основываться на разных принципах, напр. степени распознавания клинической сущности, молекулярном подтверждении или биохимических данных. Некоторые варианты, выявленные анализом однонуклеотидного полиморфизма и секвенирования экзома, могут идентифицировать новые заболевания.
Один из примеров использования этих технологий для обнаружения нового диагноза описывает двух братьев, родители которых состояли в двоюродном родстве. У братьев был рано начавшийся синдром спастической атаксии-невропатии со спастичностью мышц нижних конечностей, периферической невропатией, птозом, глазодвигательной апраксией, дистонией, атрофией мозжечка и прогрессирующей миоклонической эпилепсией. Гомозиготная миссенс-мутация (c.1847G>A; p.Y616C) в AFG3L2, которая кодирует СЕ митохондриальной протеазы, была идентифицирована путем секвенирования экзома. Белок AFG3L2 может связываться с др. молекулой AFG3L2 или с параплегином.
Чтобы доказать, что мутация пациентов влияет на определенную аминокислоту, участвующую в образовании обоих этих комплексов, сотрудники программы недиагностированных болезней Германии использовали дрожжи в качестве модельной системы. В результате у братьев проявились признаки и симптомы известного дефекта AFG3L2, АуД-спиноцеребеллярной атаксии 28-го типа (SCA28), а также ограничения, связанные с параличом нижних конечностей, наследственной спастической параплегией 7-го типа (SPG7). Присутствовали также др. признаки митохондриального нарушения (глазодвигательная апраксия, экстрапирамидная дисфункция, миоклоническая эпилепсия). Эти два брата представляют собой первые подобные случаи в мире и расширяют фенотип болезни AFG3L2.
Второй пример описывает двух состоящих в кровном родстве детей в возрасте 5 и 10 лет с гипотонией, задержкой развития, дисморфизмом лица, потерей слуха, нистагмом, судорогами и атрофией согласно МРТ ГМ. В этом случае главный ключ к разгадке был биохимического характера, и генетический анализ подтвердил диагноз. Тонкослойная хроматография мочи на олигосахариды выявила интенсивную полосу, определенную масс-спектрометрическим методом, которая состояла из тетрасахарида, содержащего три глюкозы и одну маннозу.
Это свидетельствовало о дефекте глюкозидазы I — первого фермента, участвующего в обрезке N-связанных гликопротеинов эндоплазматического ретикулума от высокоманнозы до сложной формы. Анализ мутаций подтвердил сложные гетерозиготные варианты в гене глюкозидазы I, позволив установить диагноз врожденного нарушения гликозилирования IIb. Двое состоящих в кровном родстве детей были вторым и третьим пациентами в мире с этим расстройством.
Иногда АуД-заболевание, обычно возникающее во взрослом возрасте, может проявляться как совершенно другое и более серьезное заболевание, когда патологические варианты одного и того же гена наследуются от каждого родителя; ребенок-компаунд-гетерозигота. Так было с 3-летним ребенком, который унаследовал два варианта в GARS — гене, вызывающем АуД-болезнь Шарко-Мари-Тута (СМТ; англ. Charcot-Marie-Tooth) 2D. У ребенка наблюдались выраженная ЗВУР и задержка послеродового роста, микроцефалия, задержка развития, атрофия зрительного нерва и изменения пигмента сетчатки, а также ДМПП. На момент обследования ребенка ни у одного из родителей симптомов не наблюдалось; результаты ЭМГ и исследования нервной проводимости у родителей были в норме.
Этот случай подчеркивает необходимость получения согласия семьи перед любым генетическим тестированием на возможность обнаружения неожиданных результатов у др. ее членов. В этом случае генетическое консультирование было расширено, чтобы выявить возможную CMT2D у родителей.
