Диагностические исследования при инфекционных заболеваниях нуждаются в правильном назначении, так же как и в интерпретации результатов. Благодаря развитию новых технологий сегодня специфические инфекционные заболевания диагностируются гораздо чаще, чем в прошлом. Так как анализы в области клинической микробиологии становятся все более комплексными, назначать и интерпретировать их результаты все сложнее; в комплексных ситуациях рекомендуется консультация врачей-инфекционистов или микробиологов.
Микробиологические тесты включают больше вариантов биологического материала (жидкость, ткань, мазок) и локализаций для забора биологического материала (легкие, ЖКТ, кости, суставы), чем другие области лабораторной медицины. Инфекции могут вызываться сотнями видов микроорганизмов, от бактерий до вирусов, грибов, простейших, паразитов и даже водорослей. Простое определение микроорганизма не означает, что именно он является причиной заболевания, так как существует возможность контаминации извне или предыдущей инфекции.
Лабораторные тесты включают прямую визуализацию (часто со специальными способами окрашивания), посевы культур (определяются в зависимости от типа микроорганизма) и молекулярные, протеомические, метаболические и иммунологические методы, спектр которых постоянно расширяется и может варьировать от лаборатории к лаборатории. В клинической практике все шире применяются МАНК возбудителей (ДНК или РНК в зависимости от микроорганизмов-мишеней). Наиболее распространенным в клинической практике методом МАНК является ПЦР, но в то же время существует много других доступных технологий.
При ПЦР специфический сегмент ДНК амплифицируется (прямо и обратно) с применением пар праймеров (рис. ниже) реакцией, включающей основные элементы синтеза ДНК (дезоксинуклеотидтрифосфатов) и термостабильной ДНК-полимеразы. Сам метод включает серийное переключение температур, чтобы ренатурировать праймеры, синтезируя между ними ДНК (функция энзима ДНК-полимеразы) с последующим конвертированием двухцепочечной ДНК в одноцепочечную для повторения реакции. Основная идея заключается в том, что к окончанию циркуляции температур целевой сегмент ДНК при его наличии был экспоненциально амплифицирован; амплифицированная ДНК определяется многими способами, включая флуоресцентно-меченые пробы, которые гибридизируют амплифицированную ДНК в течение реакции ПЦР (так называемая ПЦР в реальном времени).
Для измерения ответов хозяина на инфекцию могут быть применены традиционное серологическое тестирование, определение высвобождения интерферона-γ и более современное измерение транскрипционного или протеомного ответа. Специализированное тестирование в местных лабораториях не проводится и может быть перенаправлено в референтную лабораторию. Выделенные из культур микроорганизмы исторически могут быть идентифицированы биохимическими методами, но в настоящее время все более популярными становятся методы протеомной технологии, времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией, которые способны в течение нескольких минут точно идентифицировать огромное количество бактериальных и грибковых изолятов.
Качество микробиологических результатов зависит не только от тестирования в лаборатории, но и от правильного выбора, отбора и транспортировки проб биологического материала для исследования. Идеальными условиями для микробиологического тестирования, особенно для посевов, является начало исследования до назначения АБ. Для лиц, осуществляющих забор биологического материала, важно обеспечить его адекватный забор; пробы плохого качества могут быть отвергнуты лабораторией, но только лаборатория может определить их как непригодные (например, предполагаемая мокрота на самом деле представляет собой орофарингеальный секрет).
Некоторые методы исследования не подходят для определенных биологических материалов (анаэробные культуры в мокроте). Марлевые тампоны удерживают минимальные объемы и могут быть рекомендованы только в ограниченных случаях (мазок из горла на S. pyogenes при фарингите), все чаще используются флок-тампоны, которые эффективно освобождаются от содержимого. Тем не менее, если возможно взятие для исследования проб жидкости или ткани, это почти всегда эффективнее тампонов.
При микробиологическом исследовании следует ответить на три вопроса. Первый вопрос состоит в том, является ли заболевание пациента микробным по природе. Второй вопрос заключается в определении микроорганизмов, вызвавших заболевание, и третий вопрос состоит в определении методов лечения пациента. Если лечение не может быть непосредственно связано с природой установленного микроорганизма, проводится тест на чувствительность, обычно у выращенной культуры. Далее представлены общие микробиологические тесты.
а) Посевы крови. Стандартные посевы крови, обычно после 5-дневной инкубации при использовании современного оборудования, с постоянным мониторингом, способствуют выявлению большинства культивируемых бактерий наряду с большинством видов Candida. Микобактерии и диморфные грибы в идеале требуют особых культур крови и более длительной инкубации. Забор оптимального объема крови, а также взятие крови на посев перед назначением АБ являются надлежащей практикой обеспечения качества для стандартных посевов крови. У взрослых рекомендовано взятие двух проб крови из разных вен, каждая проба должна содержать 20-30 мл крови, которые помещают по меньшей мере в один аэробный и один анаэробный флакон для каждого анализа.
В разделении посевов крови в долгосрочной перспективе необходимости нет. Единичный посев культур строго не рекомендован. Клиницистам сообщают, когда посевы крови становятся положительными; к этому моменту, возможно, станет понятным, являются ли микроорганизмы патогенами или контаминантами, по результатам должны быть сделаны клинические выводы с их возможным пересмотром при получении дальнейших результатов тестирования флакона с положительным посевом крови. Контаминация посевов крови происходит достаточно часто, с допустимой частотой 3% и может привести к клиническим заблуждениям. Контаминацию можно распознать, если после однократного исследования в посевах крови высеваются такие микроорганизмы, как коагулазоотрицательные стафилококки или коринебактерии.
Для минимизации риска контаминации в идеале нужна венесекция; область венепункции должна быть тщательно дезинфицирована (хлоргексидином или 2% йодной настойкой).
В настоящее время многие лаборатории используют быстрые методы, такие как мультиплексные молекулярные панели для идентификации бактерий и грибов Candida, растущих во флаконах с положительными посевами крови, а также для определения отдельных генов АБ-резистентности. Эти тесты идеально подходят для строгого контроля эффективности АБТ.
Хотя полученные из ЦБК посевы в целом не одобряются, такие посевы, выполненные одновременно со взятием проб периферической крови, могут быть полезны для диагностики катетер-ассоциированной бактериемии. Если при обоих посевах имеется рост одинаковых микроорганизмов и посев крови из ЦБК становится положительным через >2 ч перед ростом культуры из периферической крови, высока вероятность катетер-ассоциированной инфекции циркулирующей крови. Если катетер-ассоциированная бактериемия определяется при наличии многопросветного ЦВК, следует подумать о взятии проб крови из каждого просвета наряду с пробой из периферической крови.
Для диагностики инфекционного эндокардита предполагается выполнение стандартных посевов крови. В случае отрицательного результата следует оценить необходимость серологического исследования на бартонеллез и лихорадку Q. Для гистопатологической диагностики инфекционного эндокардита после резекции клапанов можно использовать окрашивание и методы молекулярной диагностики (такие как ПЦР/последовательность 16S рибосомного гена РНК, МАНК для Tropheryma whipplei).
б) Анализ спинномозговой жидкости. Анализ СМЖ может быть информативен для диагностики менингита и некоторых случаев энцефалита (ВПГ и энтеровирусные инфекции). Для всех исследований необходимо достаточное количество биологического материала; полезно осуществлять забор некоторого избытка жидкости для хранения в случае необходимости дополнительных исследований (чтобы не выполнять повторную люмбальную пункцию). Обычно в отдельные пробирки набираются три или четыре аликвоты СМЖ. Первая обладает наибольшим потенциалом для контаминации, поэтому ее не следует применять для микробиологических исследований.
Для диагностики бактериального менингита окраска по Граму производится после клеточного центрифугирования СМЖ с проведением бактериальных посевов (наряду со стандартными посевами крови), а также подсчетом количества клеток, определением клеточной формулы, глюкозы и белка. МАНК для СМЖ является методом выбора для диагностики менингита/энцефалита, вызванных энтеровирусами или ВПГ. Хотя FDA США утвердило многокомпонентный МАНК для диагностики менингита и энцефалита, он не может рассматриваться в качестве заменителя посевов, поскольку не является всеобъемлющим и вследствие сообщений о специфических возбудителях.
Тестирование СМЖ с использованием криптококкового АГн следует применять для быстрой диагностики менингита, вызванного Cryptococcus neoformans/gattii. Для диагностики менингита, вызванного микобактериями туберкулеза, рекомендованы мазок с целью выявления кислотоустойчивых бактерий и посев с использованием больших объемов СМЖ (>5 мл) наряду с ТАНК.
в) Анализ образцов из дыхательных путей. Фарингит, вызванный S. pyogenes, диагностируют путем забора мазка из глотки и миндалин (избегая зубов, десен и щек) и анализа методом посева, экспресс-теста с АГн или МАНК. Отрицательные результаты экспресс-теста на АГн S. pyogenes, особенно у детей, следует подтверждать посевом или МАНК. МАНК идеально подходит для обнаружения респираторных вирусов. Последующий мазок из носоглотки для обнаружения Bordetella pertussis с помощью МАНК является предпочтительным подходом для диагностики коклюша. Доступны мультиплексные панели для МАНК; их оптимальная роль в клинической практике в данный момент уточняется.
В случае внебольничной пневмонии, при которой возможно амбулаторное лечение, специфическое исследование обычно является необязательным. В случае госпитализации пациента с внебольничной пневмонией рекомендуется выполнить посевы крови с окрашиванием по Граму и посев мокроты, а в случае тяжелого течения заболевания — анализ мочи на АГн Legionella pneumophila и S. pneumoniae. МАНК является диагностическим методом выбора для пневмонии, вызванной Mycoplasma pneumoniae, и, хотя это очень редкий патоген, для Chlamydophila pneumoniae. Для диагностики легионеллеза могут быть применены МАНК и посев секрета из НДП, причем первый метод более чувствителен, чем второй.
Для диагностики госпитальной и ИВЛ-ассоциированной пневмонии у неинтубированных пациентов могут быть исследованы мокрота, индуцированная мокрота или назотрахеальный аспират; у интубированных пациентов исследуется эндотрахеальный аспират путем окрашивания по Граму и посева. Доступны мультиплексные панели для МАНК; их оптимальная роль в клинической практике в данный момент уточняется.
Для диагностики легочного туберкулеза выделяемая мокрота (так же как индуцированная мокрота или пробы, полученные при бронхоскопии) должна быть взята для мазка на кислотоустойчивые бактерии (три пробы), для посева микобактерий (три пробы) и МАНК для микобактерий туберкулеза (одна проба). В случае положительного результата мазка на кислотоустойчивые бактерии отрицательный результат МАНК делает диагноз легочного туберкулеза маловероятным. Для пациентов с отрицательным результатом мазка на кислотоустойчивые бактерии со средним или высоким уровнем подозрения на легочный туберкулез отрицательный результат МАНК для М. tuberculosis не исключает наличия легочного туберкулеза. Некоторые МАНК для М. tuberculosis позволяют одновременно выявить микроорганизмы и быстро определить молекулярную чувствительность к ЛС (рифампину + изониазиду).
Следует отметить, что исследование высвобождения γ-интерферона и кожные пробы с туберкулином не осуществляют ДД латентного и активного туберкулеза и положительны не во всех случаях активного туберкулеза.
г) Анализы кала. Внебольничная диарея часто разрешается самостоятельно через <1 нед; в лабораторной диагностике необходимости обычно не возникает, до тех пор пока у пациента не появятся лихорадка, гематохезия, дизентерия, выраженные боли в животе, дегидратация, нарушение иммунитета или потребность в госпитализации. Для диареи путешественников или внебольничной диареи, продолжающихся >1 нед, лабораторная диагностика может оказаться информативной. Стандартные посевы кала обычно применяются для выявления сальмонелл, шигелл и кампилобактерий, а также должны включать оценку методами МАНК или АГн-анализа, продуцирующей токсин Шига кишечной палочки.
Посевы Vibrio и Yersinia могут быть дополнительными специфическими тестами с применением соответствующих сред. Инфекции, вызванные Giardia, Cryptosporidium или Cyclospora cayetanensis, могут проявляться аналогично бактериальному гастроэнтериту, и микроорганизмы хорошо выявляются с помощью определения АГн или МАНК.
Аналогично этому норовирусы и другие вирусы, вызывающие гастроэнтериты, хорошо выявляются с помощью МАНК. Ротавирусы альтернативно могут быть выявлены путем исследования с определением АГн. Патогены бактериальных, паразитарных и вирусных острых гастроэнтеритов могут быть определены одновременно в одном исследовании с коммерческими многокомпонентными МАНК; результат может быть получен в течение 1 ч.
C. difficile-ассоциированная диарея часто связана с предшествующим применением АБ или госпитализацией, хотя также отмечаются случаи внебольничной инфекции. При подозрении на С. difficile-ассоциированную диарею рекомендовано специальное исследование жидкого стула с определением АГн глутаматдегидрогеназой, а также токсинов А и В с выявлением АГн (с применением в качестве арбитра МАНК или без него) или применением МАНК с тестированием токсинов. В качестве альтернативы возможно применение изолированного МАНК, предоставляя информацию о возможном наличии у пациента С. difficile-ассоциированной диареи.
д) Исследование мочи. ДД бессимптомной бактериурии, цистита и пиелонефрита требует клинической оценки, поскольку результаты окрашивания по Граму и результаты посевов могут быть схожими при всех трех патологиях. Предназначенные для бактериального посева пробы следует собирать с учетом минимизации контаминации микрофлорой промежности. Применение для мочи транспортных сред или замораживание проб после их взятия по правилу катетеризации «введение и извлечение» снижает возможность роста контаминирующих микроорганизмов, способных привести к ложноположительным результатам. Пробы мочи у пациентов с мочевым катетером даже в течение нескольких часов часто приводят к колонизации микрофлоры с образованием биопленки на поверхности катетера; такая ситуация не способствует получению точной информации об инфекции МВП.
Для диагностики острого бактериального простатита применяется классическое правило четырех порций Meares и Stamey, при котором первые 10 мл мочи пропускаются, средняя порция мочи отражает секрецию простаты, и 10 мл мочи после массажа простаты могут быть использованы. Результаты считаются положительными, если есть 10-кратное превосходство количества бактерий в порции мочи после массажа по сравнению со средней порцией. В качестве альтернативы возможно применение версии с двумя пробами, включающей только среднюю порцию мочи и отражающей секрецию простаты.
е) Тестирование восприимчивости к противомикробным препаратам. Если лечение не имеет прямой зависимости от определения/идентификации микроорганизма, следует выполнить тестирование на АБ-чувствительность. В связи с возрастающей резистентностью к АБТ в настоящее время информация о результатах чувствительности имеет большее значение, чем в прошлом. Для этого необходимо, чтобы инфицированные резистентными бактериями пациенты оперативно выявлялись и получали соответствующее лечение, а также чтобы пациенты, инфицированные чувствительными бактериями, получали соответствующее лечение АБ узкого спектра. Бактерии могут быть резистентными к АБ в результате генетического обмена (как приобретающие резистентность плазмиды) или в результате мутации (резистентность к макролидам в результате генетических мутаций рибосомальных генов РНК).
В некоторых случаях механизмы резистентности к специфическим АБ-комбинациям настолько специфичны, что тестирование молекулярной чувствительности невозможно (как при определении генов тесА и тесС для диагностики MRSA). В других случаях механизмы молекулярной резистентности имеют комплексный характер, препятствующий правильному предварительному определению фенотипической чувствительности упрощенными молекулярными подходами (резистентность кишечной палочки к цефтриаксону). «Золотым стандартом» является метод определения, включающий выращивание микроорганизмов в присутствии специфических АБ-концентраций и при их отсутствии с последующим сравнением результатов. Традиционным измерением восприимчивости является МИК, которая представляет наименьшую концентрацию АБ, подавляющего рост микроорганизма.
Методы определения МИК стандартизированы, включая одинаковые количества микроорганизмов и условия выращивания, такие как среда, условия инкубации и ее продолжительность. Для измерения МИК микроорганизм выращивается в различных клинически значимых концентрациях АБ. Разведения могут быть получены в лунках планшета для микротитрования (в качестве альтернативы — в пробирках или в чашках с агаром) и согласно правилам дублируются с применением в качестве основы 1 мкг/мл, например 0,5; 1; 2; 4; 8 и т.д. Добавляется посевная культура изолята, и после установленного времени инкубации лунки проверяются на предмет помутнения в результате роста микроорганизмов. Первая лунка с отсутствием видимых признаков роста, о чем говорит ее прозрачность, представляет МИК для этого микроорганизма. Полученные МИК посредством таблицы по интерпретации обозначаются по категориям как «восприимчивая», «промежуточная», «восприимчивая-дозо-зависимая» или «резистентная».
Термин «восприимчивая» означает, что МИК представляет достигнутую в крови или в соответствующих жидкостях организма концентрацию ЛП в результате применения рекомендуемых доз. «Устойчивая», в противоположность «восприимчивой», означает, что в результате применения рекомендуемых доз МИК не превышена. Как и у всех биологических систем, у некоторых организмов МИК находится между уровнями «восприимчивая» и «резистентная». К промежуточным результатам можно отнести такие, как «промежуточная», «восприимчивая-дозозависимая», их можно объяснить техническими отклонениями и/или возможностью применения данного АБ, но в повышенных дозах. Уровни некоторых АБ в моче настолько высоки, что их применение благодаря высоким МИК обоснованно для лечения ИМП.
В соответствии с этим для некоторых АБ могут быть применены различные интерпретации «восприимчивости» в отношении изолятов, как связанных, так и не связанных с системой мочевыделения. Точно так же различные интерпретации могут быть применены для заболеваний ЦНС (таких как менингит).
Тестирование восприимчивости автоматизировано путем применения коммерческих систем, таких как система Vitek (bioMerieux) или автоматизированная микробиологическая система BD Phoenix (BD Diagnostics). При использовании автоматических систем микроорганизмы инкубируются с множественными АБ в специальном модуле, который их автоматически подсчитывает через регулярные промежутки времени.
При дисковом диффузионном тестировании инокулят наносится на поверхность агаровой пластины с диском, содержащим определенное количество АБ. Во время инкубации пластин АБ диффундируют в среду с образованием кругового градиента вокруг диска. После инкубации размеры зоны ингибирования роста используются для непрямого измерения МИК микроорганизмов. На результаты такого тестирования влияют скорость роста микроорганизмов, способность проникновения микроорганизмов в среду и другие технические факторы. Диаметр зоны ингибирования роста в результате действия АБ оценивается посредством таблицы интерпретации по таким категориям, как «восприимчивая», «промежуточная», «восприимчивая-дозозависимая» или «резистентная». При другой процедуре диффузии используются полоски (такие как ETEST), содержащие градиент концентраций АБ, которые образуют эллиптические зоны ингибирования, непосредственно коррелирующие с МИК.
