а) Профилирование экспрессии генов для прогноза и предсказания исхода. В настоящее время стала реальной возможность использования РНК для прогностических тестов, помогающих принимать клинические решения. Большинство этих тестов не определяют изменения в ДНК, а оценивают относительные уровни различных матричных РНК в опухоли.
Определенные таким образом уровни отдельных видов РНК затем анализируют посредством различных алгоритмов, проверенных как в плане прогностической информации (то есть риска рецидива и/или выживаемости в течение определенного периода времени), так и предсказательной способности (то есть вероятности того, что пациент получит пользу от данной терапии).
В качестве одной из первых разработок можно привести тест Oncotype DX для диагностики рака МЖ на ранней стадии. Этот тест определяет экспрессию 21 гена по РНК-транскриптам (5 из которых — продукты референсных генов) для вычисления показателя рецидива, который потом проходит проверку (валидацию) в плане прогноза заболевания, а также вероятности полезного эффекта ХТ для отобранных групп пациентов.
Завершены окончательные проспективные валидирующие исследования, по которым сейчас доступны лишь ограниченные данные, однако тест Oncotype DX широко применяется, помогая пациентам и врачам принять решение о целесообразности назначения ХТ. Аналогичные тесты прошли валидацию в проспективных исследованиях (например, тест Mammaprint), и сейчас вполне доступны дополнительные тесты для оценки экспрессии РНК, помогающие принимать клинические решения при лечении других типов рака.
б) Диагностические тесты в контексте таргетной терапии. Расшифровка генома рака открыла путь к таргетной терапии. Однако с появлением таргетной терапии пришла и необходимость «сопутствующей диагностики», то есть в генетического тестирования, для отбора пациентов, которые с наибольшей вероятностью дадут клинический ответ на данный терапевтический агент.
Ранние исследования трастузумаба, вероятно, закончились бы неудачей, если бы не провели предварительный отбор пациентов с амплификацией HER2, учитывая, что большинство больных раком МЖ имеют HER2-негативный статус.
Хотя секвенирование ДНК по Сэнгеру в течение многих лет считалось «золотым стандартом» как в научных исследованиях, так и в клинических лабораториях, секвенирование следующего поколения в большой степени вытеснило технологии секвенирования I поколения в научных работах и сопутствующей онкологической диагностике.
Методика секвенирования следующего поколения включает создание «библиотек» ДНК, которые секвенируются одновременно (то есть параллельно и в больших количествах), генерируя при этом терабайты информации. Избыточное секвенирование необходимо, чтобы гарантировать многократное секвенирование каждого нуклеотида, чтобы провести ДД истинных мутаций от артефактов самой процедуры секвенирования.
Затем каждую секвенированную молекулу ДНК сравнивают с референсным (эталонным) геномом, чтобы выявить наличие или отсутствие мутаций.
Поскольку эталонные геномы получают из различных источников, то не всегда возможно отличить мутацию от нормального варианта, который может существовать в популяции. Как таковые «секвенирование и фильтрация родоначальной линии» стали обычным делом при секвенировании ДНК опухолей. Данная процедура включает в себя получение образца нормальной ДНК от пациента, опухоль которого секвенируется, и выполнение секвенирования следующего поколения нормальной ДНК зародышевой (родоначальной) линии.
После секвенирования и выравнивания полученных последовательностей ДНК зародышевой линии «вычитают» электронным способом из ДНК опухоли, чтобы выявить только соматические мутации. Хотя этот процесс позволит снизить число ложноположительных мутаций, но он может также отфильтровать важные мутации зародышевой линии, которые могут иметь терапевтическое значение для данного типа рака (например, BRCA1, BRCA2, MLH1 и MSH2), так как он обычно выполняется автоматически до того, как пользователь проводит какой-либо анализ данных.
Новейшие методы биоинформатики могут обойти эти сложности, либо не фильтруя мутации в родоначальной линии в генах типа ранее упомянутых, либо определяя вероятность соматических мутаций по сравнению с мутациями зародышевой линии с использованием статистических алгоритмов.
Продолжаются дальнейшие клинические исследования тестирования ДНК раковых клеток в качестве рутинного средства диагностического обследования. Так, завершено экспертное исследование анализа образцов стула, которое показало относительно высокую чувствительность и специфичность при диагностике колоректального рака на ранней стадии.
Эта многоцелевая тест-система для исследования стула включает в себя тесты на наличие мутаций, эпигенетических маркеров и иммунологическую пробу на Hb, и в настоящее время она разрешена FDA в целях скрининга колоректального рака.
Благодаря секвенированию следующего поколения также удалось реализовать концепцию «жидкой биопсии» для диагностики рака. Хотя раньше под «жидкой биопсией» имели в виду анализ опухолевых клеток в кровотоке, в последнее время этот термин применяют и при тестировании циркулирующей внеклеточной ДНК. Было показано, что все клетки (как раковые, так и нормальные) выделяют ДНК в кровоток.
Эту внеклеточную ДНК можно выделить и проанализировать с помощью секвенирования следующего поколения для различных целей, включая выявление опухолевой ДНК из различных субстратов, например из плазмы и сыворотки крови, мочи, слюны и др..
Теперь секвенирование следующего поколения, наряду с его предшественником — цифровой ПЦР и другими технологиями, стало обычным методом для обнаружения мутаций опухолевых клеток в кровотоке; недавно FDA разрешил анализ крови на мутации при раке легкого в качестве дополнительного диагностического средства для таргетной терапии мутантного EGFR. Помимо сопутствующей диагностики, изучается также возможное применение внеклеточной ДНК в качестве маркера остаточной опухолевой нагрузки для оценки ответа на терапию и прогноза заболевания.
Кроме того, бессимптомный клональный гемопоэз, при котором предраковые стволовые клетки накапливают генные мутации, повышающие риск малигнизации, является еще одним потенциальным прогностическим маркером. Методики на основе новых технологий способны революционизировать лечение рака на ранних и поздних стадиях, предоставляя точные сведения о том, насколько данная терапия позволила устранить минимальную остаточную болезнь и добиться излечения.
в) Резюме. Возможность быстрой и точной идентификации мутаций и другие генетические изменения произвели революцию в осмыслении природы рака и поиска лучших путей профилактики, диагностики и лечения этой совокупности заболеваний.
Можно предвидеть будущее, в котором секвенирование генома человека по пробам крови или с помощью других неинвазивных процедур станет рутинным методом и позволит врачам быстро диагностировать рак и, что немаловажно, будет также давать информацию о наиболее эффективных методах его лечения.
