Методы выявления возбудителя эндодонтической инфекции зуба
Эндодонтическую микрофлору традиционно исследовали с применением микробиологических культуральных методов. Культивирование — процесс выращивания микроорганизмов в лабораторных условиях, с наличием необходимых питательных веществ и надлежащими физико-химическими условиями, включая температуру, влажность, давление, концентрацию солей и pH.
По существу, культуральное исследование состоит из следующих этапов: забор образцов и транспортировка, дисперсия, разведение, культивирование, выделение и идентификация. Выполняют забор эндодонтических образцов и транспортируют в лабораторию с сохраненной жизнеспособностью в поддерживающем анаэробном субстрате. После их рассеивают ультразвуком или вортексом, разводят, распределяют на различные типы агаровых питательных сред и культивируют в аэробных или анаэробных условиях.
После необходимого периода инкубации отдельные колонии субкультивируют и идентифицируют на основе различных фенотипических аспектов, включая морфологию колонии и клетки, окрашивание по Граму, насыщение кислородом тканей, комплексный биохимический анализ и газожидкостную хроматографию метаболического продукта распада. Белок внешней клеточной мембраны, как было выявлено при помощи гель-электрофореза, флуоресценции под ультрафиолетовым светом и тестов на чувствительность к определенным антибиотикам, может быть необходим для идентификации некоторых видов бактерий. Коммерческие упакованные комплекты для определения имеющихся бактериальных ферментов также использовали для быстрой идентификации некоторых видов микроорганизмов.
Культуральные исследования эндодонтических инфекций предоставили существенный объем информации об этиологии апикального периодонтита, составе эндодонтической микрофлоры в различных клинических условиях, эффектах лечебных процедур при уничтожении микроорганизмов, чувствительности эндодонтических микроорганизмов к антибиотикам и так далее.
Преимущества и ограничения методов культивирования перечислены в блоке 1 ниже; однако некоторые важные ограничения методов культивирования делают полный анализ эндодонтической микрофлоры трудновыполнимым.
Трудности при культивировании или определении видов микроорганизмов представляют специальный интерес. К сожалению, не все микроорганизмы могут быть культивированы в искусственных условиях, потому что пищевые и физиологические потребности большинства микроорганизмов все еще не известны. Независимые от культуры исследования водной и земной окружающей среды показали, что культивируемые члены данных систем составляют менее 1% от общей численности популяции.
Кроме того, 50-80% бактериальных видов микрофлоры, связанной с организмом человека, включая полость рта, представляют собой неизвестные и все еще не культивированные бактерии.
То, что данный вид не был культивирован, не подразумевает, что его будет невозможно культивировать в будущем. Бесчисленное множество облигатных анаэробных бактерий не было культивировано в начале 1900-х, но дальнейшее развитие анаэробных методов культивирования в большой степени помогло решить эту проблему. Можно предположить, что ни один единственный метод или среда культивирования не подойдут для выделения обширного разнообразия микроорганизмов, существующих в окружающей среде. Поскольку еще неизвестны условия для роста многих бактерий, необходимы методы определения микроорганизмов, не основанные на культивировании.
В некоторых ситуациях даже успешное культивирование микроорганизмов не означает, что данный микроорганизм может быть успешно идентифицирован. Идентификация культивированных микроорганизмов основана на фенотипических чертах, наблюдаемых в референтном штамме с предсказуемыми биохимическими и физическими свойствами при оптимальных условиях роста. Однако многие факторы, связанные с фенотипом, могут привести к трудностям при идентификации и даже к ошибочной идентификации. Вследствие данных факторов, анализ фенотипа не всегда позволяет однозначно идентифицировать микроорганизм.
Для преодоления ограничений методов культивирования методы и процедуры на основе молекулярной биологии стали доступными и значимо улучшили возможность более реалистичного описания микробного мира без потребности в культивировании (рис. 1). Молекулярные технологии также применяли к культивированным бактериям, включая штаммы с нетипичными или абберантными фенотипическими проявлениями, редко выделенные, плохо описанные или неохарактеризованные бактерии и новые разновидности.
Рисунок 1. Процентное распределение бактериальных видов/филотипов, найденных при эндодонтических инфекциях согласно использованному методу определения. Данные относятся к проценту видов или филотипов в целом или в каждом из девяти типов, которые являются типичными эндодонтическими представителями
Молекулярные подходы микробной идентификации основываются на определении генов, которые содержат информацию о микробной идентичности. Из нескольких генов, которые были выбраны в качестве объектов для идентификации бактерий, рибосомный ген 16 16S рРНК (или 16 rDNA) наиболее широко используется, потому что он универсален среди бактерий, достаточно длинный, чтобы быть очень информативным, и достаточно короткий, чтобы быть легко упорядоченным, обладает сохраненными и вариабельными участками и предоставляет надежность для выведения филогенетических отношений. Точно так же рибосомный ген 18S грибов и других эукариотов использовался для определения этих организмов.
Данные из последовательностей 16S рРНК гена могут использоваться для точной и быстрой идентификации известных и неизвестных бактериальных штаммов, используя методы, которые не требуют культивирования. Ген 16S рРНК фактически всех бактериальных разновидностей в данной окружающей среде, включая все еще некультивированные и неохарактеризованные бактерии, может быть амплифицирован путем применения ПЦР с большим количеством праймеров (универсальная ПЦР), которые комплементарны консервативным областям данного гена. Секвенирование вариабельных участков с большим количеством праймеров предоставит информацию для точной идентификации бактерий.
Праймеры или зонды, комплементарные вариабельным областям, могут также быть разработаны для обнаружения определенных таргетных видов микроорганизмов в клинических образцах.
Существует много молекулярных методов для исследования микроорганизмов; выбор конкретного подхода зависит от поставленных вопросов. Большой диапазон ПЦР, сопровождаемый клонированием и секвенированием, может использоваться для объяснения широты микробного разнообразия в данной окружающей среде. Бактериальные сообщества могут быть проанализированы через технологию пиросеквенирования и методами пептидных карт (метод «отпечатков пальцев»), такими как денатурирующий градиентный гель-электрофорез (DGGE) и анализ полиморфизма длин концевых рестрикционных фрагментов генов 16S рРНК (T-RFLP). Флюоресцентная гибридизация in situ может измерить численность целевых видов и предоставить информацию об их пространственном распределении в тканях.
Среди других методов ДНК-ДНК гибридизация (методы «шахматной доски», ДНК-микрочип), видоспецифическая ПЦР, вложенная ПЦР, мультиплексная ПЦР и количественная ПЦР в реальном времени могут использоваться для изучения большого количества клинических образцов для определения целевых видов. Вариации ПЦР могут также использоваться для идентификации микробных штаммов. Как и у любого другого метода, у молекулярных методов есть свои собственные преимущества и недостатки (блок 2).
а) Пять поколений эндодонтических микробиологических исследований. Микробиологические исследования для идентификации видов микроорганизмов, вызывающих эндодонтические инфекции, могут быть хронологически разделены на 5 поколений на основе различных стратегических подходов. Данные поколения детально описаны в табл. 1.
б) Влияние молекулярных методов на эндодонтическую микробиологию. В культуральных исследованиях (первое поколение) определили ряд видов микроорганизмов, которые играют важную роль в патогенезе апикального периодонтита. Следует отметить, что результаты не только культуральных методов исследований были утверждены, но они также были дополнены результатами методов культурально-независимой молекулярной биологии, которые составляют другие 4 поколения эндодонтических исследований микробиологии. Молекулярные методы подтвердили и усилили связь многих культивируемых бактериальных видов с апикальным периодонтитом, а также выявили новые эндопатогены.
Список патогенных микроорганизмов расширился и включает сложно культивируемые или пока еще не культивированные микроорганизмы, которые никогда не обнаруживали при культуральном исследовании эндодонтической инфекции. Результаты молекулярных исследований значительно влияют на знания бактериального разнообразия при эндодонтической инфекции. Больше чем 400 различных бактериальных видов были уже обнаружены при различных типах эндодонтических инфекций. Из них примерно 45% выявлено в исследованиях молекулярной биологии, тогда как 32% обнаружили только методами культивирования. 23% от всех бактериальных видов были обнаружены и при культивировании, и при молекулярных исследованиях (рис. 2).
Рисунок 2. Бактериальные типы с их соответствующими эндодонтическими представителями. Справа: пример видов или филотипы для каждого типа
Следовательно, становится очевидным, что эндодонтическая микрофлора была точнее изучена и пересмотрена посредством молекулярных методов.
