При проведении лабораторных исследований у детей трудно установить референтные значения (референтные интервалы). При разработке референтных значений лабораторных показателей нужно учитывать генетические различия, особенности физиол. развития ребенка, факторы внешней среды, бессимптомное течение заболевания.
Кроме того, при определении референтных интервалов пол и возраст ребенка также имеют значение. Наиболее часто референтный диапазон задается как среднее арифметическое референтных значений в популяции ±2 SD. Это допустимо, когда распределение наблюдаемых значений в исследуемой популяции подчиняется нормальному (Гауссовому) закону. Концентрация натрия в сыворотке крови у детей находится под строгим физиол. контролем и имеет распределение, которое по существу является гауссовым, ее среднее значение ±2 SD дает диапазон, очень близкий к тому, который фактически наблюдается у 95% детей (табл. 1).
Однако не все анализируемые показатели м.б. распределены по Гауссу. Уровень креатинкиназы в сыворотке крови, который подвержен разнообразным влияниям и не имеет активного контроля, не показывает гауссового распределения, о чем свидетельствует отсутствие соответствия между фактическим наблюдаемым диапазоном и прогнозируемым средним значением ±2 SD.
В данных случаях обычно референтный интервал определяется как размах наблюдений, которые располагаются между 2,5 и 97,5 процентилями.
Пороговые значения референтного интервала обычно устанавливаются на основе крупных исследований, выполненных на больших популяциях. Примеры подобного определения пороговых значений показаны для холестерина, липопротеинов и неонатального билирубина. Пациенты, результаты которых превышают обозначенные границы, имеют риск развития заболевания в будущем. Последнее, что необходимо учитывать при представлении референтных интервалов, — ссылка на стадии полового созревания Таннера (шкала оценки половой зрелости), которая наиболее полезна при оценке функции гипофиза и гонад.
Установление общих референтных интервалов остается труднодостижимой целью. Несмотря на то что результаты отдельных лабораторий, полученные с использованием различных методов исследования, имеют возможность непосредственного сопоставления, большинство из них соотносятся достаточно трудно. Интерпретация результатов пациента должна учитывать, когда проводилось тестирование и какой метод был использован. Методы более высокого порядка, которые являются более точными, продолжают медленно развиваться. Они будут иметь решающее значение для стандартизации испытаний и установления общих контрольных интервалов.
а) Точность и прецизионность лабораторных исследований*.
P.S. * ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002. Группа Т 80. Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений.
Техническая точность является важным фактором при интерпретации результатов лабораторных испытаний. Благодаря совершенствованию методов анализа и устранения аналитических помех достоверность большинства тестов определяется в первую очередь их прецизионностью — степенью близости друг к другу независимых результатов измерений, полученных в конкретных установленных условиях. Точность — это мера близости результата теста к фактическому значению, тогда как прецизионность — это мера воспроизводимости результата. Ни один тест не м.б. более точным, чем прецизионный.
Анализ прецизионности путем повторяющихся измерений одного и того же образца при заданных условиях приводит к получению гауссового распределения со средним значением и SD. Оценкой прецизионности является коэффициент вариации (CV):
CV = (SD/M) х 100%,
где CV — коэффициент вариации; SD — стандартное (среднеквадратическое) отклонение экспериментальных величин; М — среднее арифметическое значение.
При расчете CV, вероятно, не будет постоянным на всем диапазоне полученных при клиническом исследовании значений, но в пределах нормальных значений он составляет ~5%. Значение CV всегда известно в лаборатории. Этот показатель особенно важен при оценке значимости изменений лабораторных результатов. Напр., распространенной ситуацией является необходимость оценки гепатотоксичности, вызванной введением терапевтического ЛП, которая отражается в значении сывороточной АЛТ. Если уровень АЛТ в сыворотке крови ↑ с 25 до 40 ед/л, является ли это изменение значимым? CV для АЛТ — 7%.
Используя полученное значение ±2 х CV для выражения крайних значений неточности, значение 25 ед/л, предположительно, не отражает фактическую концентрацию >29 ед/л, а значение 40 ед/л не отражает фактическую концентрацию <34 ед/л.
Т.о., изменение значения, полученное в результате проведения анализа, вероятно отражает реальное изменение уровней АЛТ в сыворотке крови. В данном случае рекомендовано продолжение мониторинга уровня АЛТ в сыворотке крови, несмотря на то что оба значения АЛТ находятся в пределах нормы. При этом в данном случае имеет место только вероятность. Врожденная биологическая изменчивость такова, что результаты двух последовательных тестов могут указывать на тенденцию, которая исчезнет при дальнейшем тестировании.
Прецизионность теста также м.б. определена путем установления ДИ для данного результата. Обычно используются 95% ДИ, указывающие на то, что 95% полученных значений лежит в указанных пределах. ДИ рассчитываются с использованием среднего значения М и SD повторных определений:
95% ДИ = М + t х SD,
где t — константа, полученная из числа повторений. В большинстве случаев t=2.
Точность выражается в степени близости результата измерений сравниваемого метода к истинному или условно истинному (действительному, эталонному) значению, определяется разницей и смещением между ними. Окончательный или эталонный метод дает результаты с повышенной достоверностью и точностью по сравнению с клинической лабораторией. Когда эти методы используются наряду с высокоочищенными материалами (т.е. стандартными эталонными материалами Национального института стандартов и технологий) для определения значений для калибраторов анализа, используемых в клинической лаборатории, точность результатов у пациентов повышается.
Креатинин, HbA1c и неонатальный билирубин являются примерами тестов с высокой точностью.
б) Чувствительность, точность и аналитическое тестирование. В некоторых случаях чувствительность и точность анализа ↓ или ↑ в зависимости от клинической задачи. Напр., ионообменная хроматография аминокислот плазмы для диагностики врожденных ошибок метаболизма обычно выполняется с аналитической чувствительностью, позволяющей измерять все аминокислоты с помощью единого набора стандартов. Диапазон значений составляет ~20-800 мкмоль/л, при этом точность снижается при значениях <20 мкмоль/л.
Обнаружение гомоцистеина в данном анализе указывает на возможное врожденное нарушение метаболизма метионина. Если анализ скорректировать для достижения большей аналитической чувствительности, то становится возможным измерение уровня гомоцистеина в нормальной плазме (3-12 мкмоль/л). Этот более чувствительный тест используется для оценки кобаламинового статуса и анализа факторов риска развития атеросклеротических ССЗ.
в) Прогностическая значимость лабораторных исследований. Теория прогностической значимости (ПЗ) рассматривает предсказательную ценность тестов, которая определяется их клинической чувствительностью (способностью выявлять заболевание) и специфичностью (способностью определять отсутствие заболевания).
Чувствительность = (количество положительных результатов, полученных тестом / общее количество отрицательных результатов (отсутствие болезни)) х 100.
Специфичность = (количество отрицательных результатов, полученных тестом / общее количество отрицательных результатов (отсутствие болезни)) х 100.
ПЗ+ = (ИП/ПР) х 100.
ПЗ- = (ИО/ОР) х 100.
Среди основных проблем, рассматриваемых теорией ПЗ, — это л/о и л/п результаты тестов. 14 те и другие являются важными при интерпретации результатов скрининговых тестов в целом и неонатальных скрининговых тестов в частности.
Тестирование серореактивности ВИЧ иллюстрирует некоторые из этих соображений. Если предположить, что 1,1:284 млн жителей США инфицированы ВИЧ (распространенность = 0,39%) и что 90% инфицированных демонстрируют АТл к ВИЧ, то мы можем рассмотреть полезность теста с ЧС 99/99,5% (см. главу 302). Если бы все население США было обследовано, то можно было бы выявить большинство инфицированных ВИЧ:
1 100 000 х 0,9 х 0,99 = 980 100 (89,1%).
Однако при этом будет получено 119 900 л/о результатов теста. Даже при специфичности 99,5% количество л/п результатов теста будет больше, чем количество истинно «+» (ИП) результатов:
284 000 000 х 0,0005 = 1 420 000.
Кроме того, будет получено 28 148 млн истинно «-» (ИО) результатов:
Учитывая высокую стоимость последующего наблюдения и проблемы с л/п результатами, легко понять, почему всеобщий скрининг на серопозитивность к ВИЧ получил низкую оценку сразу же после введения тестирования на ВИЧ-инфекцию.
В отличие от него, мы можем рассмотреть скрининг 100 тыс. человек из групп повышенного риска заражения ВИЧ, у которых общая распространенность заболевания 10%, при этом все остальные факторы остаются неизменными.
Эти две гипотетические стратегии тестирования показывают, что диагностическая эффективность тестирования в значительной степени зависит от распространенности заболевания, на которое проводится тестирование, даже при наличии превосходного теста, такого как тест на АТл к ВИЧ. Поскольку лечение беременных женщин, инфицированных ВИЧ, эффективно предотвращает вертикальную передачу инфекции, в настоящее время скрининг проходят все беременные женщины.
Доказанная эффективность современной терапии в профилактике неонатальной инфекции привела к активизации скрининга на ВИЧ на ранних сроках беременности.
Однако из-за того, что для тестирования на АТл к ВИЧ нужно много времени, было сложно проводить скрининг женщин во время родов и обеспечивать необходимую терапию. Одобрение получили процедуры быстрого тестирования на АТл к ВИЧ с использованием капиллярной или венозной крови, плазмы или сыворотки, а также тесты с исследованием отделяемого слизистой полости рта (табл. 2). Результаты теста на ВИЧ обычно получают менее чем за 20 мин.
Сбор образцов ротовой полости является альтернативой для людей, которые избегают тестирования на ВИЧ из-за боязни уколов.
Тестирование на ВИЧ с использованием цельной крови или отделяемого слизистой полости рта классифицируется как отказ от рекомендованного теста в соответствии с Поправками по совершенствованию клинической лабораторной диагностики 1988 г., эти тесты разрешены в условиях места оказания МП. Такие тесты — это простые лабораторные процедуры, использующие методологии, которые настолько просты и точны, что делают вероятность ошибочного результата пользователем ничтожно малой.
Положительный быстрый результат теста на ВИЧ затем подтверждается методом иммуноблотинга или с помощью анализа иммунофлуоресценции.
По данным CDC, в 2014 г. в США родились 174 ребенка с ВИЧ.
Быстрое тестирование на ВИЧ во время родов позволяет проводить APT ВИЧ-инфицированным женщинам, которые не прошли тестирование или не знают о своем ВИЧ-статусе. Начало терапии во время родов или в течение первых 12 ч после рождения ребенка значительно снижает риск передачи инфекции от матери ребенку. При быстром тестировании матери и ребенка во время родов было показано, что для быстрого анализа цельной крови на ВИЧ во время родов ЧС 100/99,9%, соответственно, при ПЗ+ результата 90%. Среднее время получения результата анализа от взятия крови до уведомления пациента составило всего 66 мин.
Результаты экспресс-ана-лиза крови продемонстрировали показания лучше, чем стандартный ИФА на ВИЧ, который имел ЧС 100/99,8%, соответственно, при ПЗ+ результата 76%. Кроме того, среднее время получения результата анализа от взятия крови до уведомления пациента составило 28 ч. В результате быстрое тестирование цельной крови на ВИЧ в настоящее время является стандартом оказания помощи роженицам с неизвестным ВИЧ-статусом.
Быстрое тестирование на ВИЧ также м.б. использовано в развивающихся странах. В условиях нехватки ресурсов из-за отсутствия должным образом оборудованных лабораторий, квалифицированных экспертов и базовых ресурсов, напр. электричества и воды, эти автономные тесты на ВИЧ в пунктах оказания МП сильно востребованы. В районах Азии и Африки, где ВИЧ носит характер эпидемии, скрининг беременных женщин с помощью экспресс-тестов на ВИЧ и предложение APT могут значительно снизить передачу ВИЧ сотням тысяч младенцев.
г) Тесты неонатального скрининга. Почти все заболевания, выявленные в программах неонатального скрининга, имеют очень низкую встречаемость и по большей части тесты носят количественный, а не качественный характер. В целом стратегия заключается в использовании начального скринингового теста для выявления пациентов с высоким риском заболевания среди здоровых младенцев (т.е. увеличить распространенность), а далее целенаправленно исследовать данную группу детей. Для выявления врожденного гипотиреоза используются две основные стратегии: в одной для начального скрининга используется ТТГ, а в другой — Т4.
В стратегии по определению Т4 для выявления врожденного гипотиреоза, который имеет встречаемость 25:100 тыс. детей, родившихся живыми, первоначальный тест проводится на содержание Т4 в цельной крови. Подозрительными на врожденный гипотиреоз считаются новорожденные с самыми низкими показателями теста до 10%. Если бы все дети с врожденным гипотиреозом были включены в группу высокого риска, встречаемость заболевания в этой группе составила бы 250:100 000 детей.
Исходные образцы крови детей из группы высокого риска повторно тестируются на содержание Т4, а также на содержание ТТГ. Этот 2-й этап тестирования позволяет дополнительно выявить группу детей с повышенным риском развития заболевания, включающую 0,1% обследованных младенцев и имеющую встречаемость гипотиреоза 25:100 000 человек.
Эта последняя группа детей далее активно обследуется и направляется на лечение. Даже при 1000-кратном увеличении встречаемости заболевания 75% активно обследованной популяции имеют эутиреоз.
Программу скрининга оправдывают тем, что лечение гипотиреоза является простым и эффективным, а альтернативный вариант, когда врожденный гипотиреоз не диагностирован и не лечится, приводит к длительному повседневному уходу за ребенком, что дорого обходится и не приводит к удовлетворительным результатам.
На начальном этапе скрининг новорожденных был обусловлен отбором генетических заболеваний, клинические проявления которых развивались постнатально, таких как фенилкетонурия, галактоземия и гипотиреоз. Заболевания, отобранные для скрининга, как правило, должны были соответствовать определенным критериям. Распространенность заболевания должна была соответствовать минимуму, обычно 1:100 000. Для отбора заболеваний требовалось продемонстрировать снижение заболеваемости и смертности в неонатальном периоде. Эффективные методы лечения должны быть доступны, кроме того, в процессе отбора рассматривались стоимость скрининга и возможность лабораторного тестирования.
Более распространенные заболевания также стали мишенями для программ неонатального скрининга. СКА, легко выявляемая с помощью жидкостной хроматографии или изоэлектрической фокусировки, может лечиться более эффективно, если диагностируется до появления клинических симптомов. Кроме того, приведены результаты неонатального скрининга на муковисцидоз, которые показывают явные преимущества, связанные с доклинической диагностикой, но также демонстрируют и некоторые трудности, связанные с генетическим скринингом сложных АуР-заболеваний, которые распространены и вызваны довольно большим числом мутаций (>1500) одного гена.
Окончательный диагностический тест на муковисцидоз — это измерение концентрации хлорида в поте, но этот тест не применим в течение первой недели жизни ребенка. Новорожденные с муковисцидозом обычно имеют повышенное содержание трипсиногена в цельной крови. Этот тест позволяет идентифицировать группу новорожденных, подверженных риску развития муковисцидоза. К сожалению, трипсиноген в качестве начального скринингового теста имеет высокий уровень л/п результатов, что является его минусом, кроме того, он вызывает лишнюю тревогу у родителей и семей новорожденных, а также является дорогостоящим из-за времени и затрат на медицинское наблюдение.
Проведение анализа ДНК на наличие распространенных мутаций, вызывающих муковисцидоз, уменьшает размер подозрительной группы и выявляет новорожденных с более высокой вероятностью заболевания. Эта двухуровневая стратегия определяет контролируемое количество детей, для которых необходимо провести тесты на потливость. Среди проблем:
1) необычные мутации не включены в скрининговую панель, т.о., случаи муковисцидоза, вызванные этими мутациями, м.б. пропущены;
2) распространенные мутации, которые вызывают клинически незначительное повышение уровня трипсиногена в цельной крови у гетерозиготных новорожденных, вызывают потенциально тревожные л/п результаты;
3) муковисцидоз у пациентов с нормальными результатами теста пота редок и, скорее всего, будет не диагностирован.
Тандемная масс-спектрометрия (МС) — это современный физико-химический метод, определения химической структуры образца или молекул путем их ионизации с образованием заряженных молекул или их фрагментов с последующим измерением отношения их массы к заряду.
Процесс занимает ~2 мин на каждый образец и может обнаружить 20 или более врожденных нарушений метаболизма. Недоношенность, заболевания в неонатальном периоде и интенсивное лечение новорожденных с введением в кровь метаболитов осложняют интерпретацию результатов. ПЗ+ результата скрининга, вероятно, будет <10%, т.е. 90% «+» результатов не укажут на генетическое нарушение обмена веществ.
Тем не менее МС позволяет поставить диагноз до развития клинических симптомов заболевания, эта технология произвела революцию в возможностях скрининга новорожденных.
МС не направлена на скрининг заболеваний, охарактеризованных как излечимые, однако она направлена на идентификацию всех редких заболеваний.
Электрораспыление в масс-спектрометрии позволяет выявлять редкие врожденные нарушения метаболизма и было внедрено в качестве инструмента скрининга новорожденных во всем мире. С 1998 г., когда в Австралии была внедрена МС, коэффициент обнаружения редких врожденных нарушений метаболизма составил 15,7 случая на 100 тыс. детей, родившихся живыми, что значительно выше показателя 8,6-9,5 случая на 100 тыс. детей в предшествующие 24 года.
Нарушения окисления жирных кислот, в частности дефицит среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы (см. главу 104), были причиной большинства диагнозов с повышенными показателями. Расширенные программы скрининга новорожденных с использованием МС увеличивают выявление наследственных метаболических нарушений. Все штаты США используют МС в программах неонатального скрининга, метаболические условия скрининга варьируются от 31 до >50.
В попытке стандартизировать программы скрининга новорожденных Американский колледж медицинской генетики рекомендовал, чтобы каждый ребенок, родившийся в США, проходил скрининг на наличие основной группы из 29 заболеваний (табл. 3).
Были рекомендованы для скрининга еще 25 заболеваний в качестве вторичных мишеней, поскольку их можно идентифицировать при скрининге основных групп расстройств. March of Dimes (некоммерческая организация США, которая работает над улучшением здоровья матерей и детей) и ААР также поддерживают рекомендации Американского колледжа медицинской генетики. Однако расширение спектра скрининговых тестов вызывает ряд вопросов.
Стоимость реализации такого скрининга м.б. значительной, поскольку многим государствам потребуется много МС. Сложной задачей может стать укомплектованность лабораторий квалифицированным техническим персоналом для запуска системы и квалифицированными учеными для интерпретации результатов. С помощью этих программ скрининга также будет получен ряд л/п результатов. Многие из них — результат парентерального питания, биологических изменений или лечения и не являются результатом врожденной поломки метаболизма. Следовательно, потребуется квалифицированный персонал для обеспечения контакта с пациентами с аномальными результатами, их последующего тестирования и консультирования, если это необходимо.
Даже с учетом этих опасений отчет рекомендаций Американского колледжа медицинской генетики является шагом в правильном направлении к стандартизации руководства государственных программ скрининга новорожденных.
д) Тестирование в уточнении дифференциального диагноза. Использование лабораторных тестов для уточнения ДД удовлетворяет теории ПЗ, поскольку правильный ДД должен приводить к относительно высокой распространенности рассматриваемого заболевания. Примером тестирования в уточнении ДД является измерение мочевой ванилилминдальной кислоты для диагностики нейробластомы. Простой точечный тест на ванилил-миндальную кислоту не полезен в общих скрининговых программах из-за низкой распространенности нейробластомы (3:100 тыс. случаев) и низкой чувствительности теста (69%).
Несмотря на то что специфичность теста на мочевую ванилилминдальную кислоту составляет 99,6%, тестирование 100 тыс. детей дало бы 2 ИП результата теста, 400 л/п результатов и 1 л/о результат. ПЗ+ результата в этом случае составляет 0,5%, а ПЗ- результата — 99,99%, что мало чем отличается от предположения об отсутствии нейробластомы.
Однако тестирование на мочевую ванилилминдальную кислоту у трехлетнего ребенка с объемным образованием БП дает полезный результат, поскольку распространенность нейробластомы у трехлетних детей с объемными образованиями в БП составляет не <50%. Если протестировать 100 таких детей и предположить, что распространенность нейробластомы в группе составляет 50%, то получается удовлетворительная ПЗ.
ПЗ+ = (0,69 х 50) / (0,69 х 50 + (0,004 х 50)) х 100 = 99%.
ПЗ- = (0,996 х 50 / (0,996 х 50 + (0,31 х 50)) х 100 = 76%.
Т.о., в данной ситуации тест с низкой чувствительностью является мощным средством уточнения диагноза, поскольку вероятность «+» результата составляет почти 100% при высокой распространенности заболевания.
1. Серологическое тестирование. Использование лабораторных тестов для ДД создает проблемы, примером чего может служить серологическое тестирование на болезнь Лайма, которая представляет собой клещевую инфекцию Borrelia burgdorferi, имеющую различные проявления как на ранних, так и на поздних стадиях инфекции (см. главу 249). Прямое доказательство инфекции затруднено, а результаты серологических тестов на болезнь Лайма не являются достоверными у маленьких пациентов, у которых имеются ранние проявления хронической мигрирующей эритемы.
Эти результаты становятся «+» через несколько недель после заражения и остаются «+» в течение ряда лет. В более старшем возрасте, когда проходит тестирование на позднюю стадию болезни Лайма, некоторые пациенты выздоравливают либо от клинической, либо от субклинической болезни Лайма, а у некоторых развивается активная болезнь Лайма, причем обе группы будут иметь ИП результаты серологических тестов. Среди пациентов без болезни Лайма некоторые будут иметь ИО результаты серологических тестов, но значительный процент будет иметь АТл к др. организмам, которые перекрестно реагируют с АГн В. burgdorferi.
Такое стечение обстоятельств порождает целый ряд проблем. Во-первых, многогранный характер болезни Лайма затрудняет обеспечение высокого показателя точности определения распространения заболевания среди тестируемых лиц. Во-вторых, наиболее подходящие АТл, которые нужно обнаружить, определяются несовершенно, что приводит к широкому спектру тестов с различной частотой л/п и л/о результатов. В-третьих, естественная реакция АТл на инфекцию и трудность непосредственного выявления возбудителя болезни Лайма делают лабораторную диагностику ранней стадии болезни Лайма трудной.
В-четвертых, при диагностике поздней стадии болезни Лайма у более старших детей лабораторный диагноз страдает от вводящих в заблуждение «+» (либо л/п, либо ИП, но клинически не значимых) результатов, как правило, ИФА, который использует целые организмы В. burgdorferi. В обзоре 788 пациентов, направленных в специализированную клинику с диагнозом болезни Лайма, диагноз был верен у 180 пациентов, 156 пациентов имели ИП результаты серологического исследования без активной формы болезни Лайма, а 452 никогда не имели болезни Лайма, хотя 45% из них были серопозитивными по крайней мере при тестировании одним тестом.
Для оценки заболеваемости часто применяется двухэтапный подход, аналогичный тому, который используется при тестировании на ВИЧ: скрининговый тест с высокой чувствительностью (напр., ИФА) и отличная ПЗ- результата, за которым следует очень специфичный подтверждающий тест для проверки «+» результатов скрининга (напр., вестерн-блот для обнаружения АТл к выбранным бактериальным антигенам). Отрицательные результаты скрининговых тестов и «-» результаты проверочных тестов регистрируются как «-».
Положительные результаты проверочного теста регистрируются как «+». Однако стандартизация процедур тестирования затруднена в Северной Америке, где обнаружен только один патогенный штамм В. burgdorferi, и еще более затруднена в др. частях Северного полушария, где присутствует до трех патогенных штаммов.
Идентификация микробной ДНК в биологических жидкостях с помощью ПЦР является окончательной, но для этого используется инвазивный способ получения клинического материала.
2. Лабораторный скрининг. Профили скрининга используются как часть полного обзора систем, чтобы установить исходные показатели или облегчить уход за пациентом в конкретных обстоятельствах, таких как: 1) когда пациент явно болен, но конкретный диагноз остается неустановленным; 2) когда пациент нуждается в интенсивной терапии; 3) для контроля за результатами клинического использования вакцин и для оценки нового ЛС; 4) когда используется ЛП, который, как известно, имеет системные побочные эффекты.
Лабораторные скрининговые тесты должны использоваться целенаправленно, чтобы дополнить, а не вытеснить полный анамнез и физикальное обследование (табл. 4).
