Использовать ботулинический нейротоксин (БоНТ) в лечебных целях впервые предложил Alan Scott. В первых попытках лечения страбизма он применял комплекс ботулотоксина Clostridium botulinum типа А, который изготовили Edward Schantz и Eric Johnson. В то время это был кристаллический ботулотоксин. Процесс производства начинается с ферментации С. botulinum в анаэробных условиях, в сложной среде, содержащей пептиды и сахара.
Бактерии вырабатывают комплекс, состоящий из нескольких белков, один из которых и есть ботулотоксин - активное вещество всех препаратов ботулинического нейротоксина (БоНТ). Кроме серотипа А, известны еще шесть серотипов токсина: В, C1, D, Е, F и G.
В лечебных целях используются только серотипы А и В. Кроме того, существуют многочисленные подтипы (например, подтипы А1-А8 серотипа А), и к настоящему времени описано более 40 их видов. Все доступные на рынке эстетической медицины препараты содержат БоНТ серотипа А1. Препарат на основе подтипа серотипа В, одобренный только для неврологических показаний, в литературе не описан.
В 1989 г. препарат, который создал Scott, был разрешен к применению для лечения страбизма, гемифациального спазма и блефароспазма. Сейчас в разных странах зарегистрированы несколько других токсинов для различных показаний. Крупным достижением в сфере эстетической медицины стало открытие Jean и Alastair Carruthers возможности применения БоНТ для коррекции морщин.
В настоящее время на западном рынке представлены три препарата, одобренные FDA для применения по эстетическим показаниям: OnaBTX-А (BOTOX/Vistabel, Vistabex Allergan, Inc., Ирвайн, Калифорния), AboBTX-A (Dysport/Azzalure, Ipsen, Париж, Франция), IncoBTX-A (Xeomin/Bocouture, Merz Pharmaceuticals GmbH, Франкфурт-на-Майне, Германия).
В странах Азии также существует несколько зарегистрированных препаратов: Neuronox (Medytox, Inc.), Nabota" (Daewoong, Inc) и Botulax (Hugel) - в Корее и BTXA, или Lantox (Lanzhou Institute), - в Китае. Все препараты схожи с OnaBTX-А и, согласно заявлению производителей, содержат комплекс БоНТ с м.м. 900 кДа. В состав некоторых препаратов входят различные вспомогательные вещества. Такие препараты содержат комплексообразующие белки и в данной главе не рассматриваются.
В отличие от OnaBTX-А, AboBTX-A и других препаратов, IncoBTX-A - единственный одобренный препарат, который свободен от комплексообразующих белков и содержит только чистый БоНТ с м.м. 150 кДа, обладающий терапевтическим действием. Разработки другого препарата без комплексообразующих белков под названием Purtox были по неизвестным причинам остановлены. Компания Revance, Inc. прекратила работы по созданию наружного препарата DaxiBTX-A, но ведет разработку инъекционного препарата (RT002). Предположительно в его состав входят пептиды, связанные с БоНТ. Однако неизвестно, влияет ли это на потенциальную иммуногенность и фармакологические свойства БоНТ.
В последние годы инъекции БоНТ-А стали самыми популярными косметическими процедурами, особенно среди дерматологов и пластических хирургов. IncoBTX-A отличается по содержанию бактериальных белков и составу, что может влиять на его лечебное действие. Для оптимального использования желательно, чтобы врачи знали о свойствах препаратов, содержащих комплексообразующие белки, и препаратов, содержащих только чистый нейротоксин. В этой главе рассматриваются сходства и различия между препаратами БоНТ и выясняется, обладают ли комплексообразующие белки каким-либо действием. Особое внимание уделяется препарату IncoBTX-A.
Рисунок 1. Механизм действия БоНТ.
а) Механизм действия ботулинического нейротоксина (БоНТ). Молекулярный состав и механизм действия БоНТ чрезвычайно подробно описаны в обзорах, поэтому здесь будут представлены только основные сведения. Активная часть всех препаратов БоНТ - ботулотоксин, белок, состоящий из 1296 аминокислот, с относительно высокой м.м. 150 кДа. Для сравнения: м.м. небольшого белка инсулина составляет 5,8 кДа.
Ботулинический нейротоксин (БоНТ) синтезируется в виде одноцепочечного белка, который расщепляется клостридиальной протеазой на две субъединицы: тяжелую и легкую цепи, соединенные дисульфидной связью. С-терминальный домен тяжелой цепи высокоспецифично связывается с рецепторами пресинаптической мембраны холинергических нейронов. Тяжелая цепь включает два домена: для специфической связи с гликолипидами (GTlb) и с белковым рецептором SV2. БоНТ, связанный с рецептором, в процессе эндоцитоза проникает в нервную клетку. Затем второй домен тяжелой цепи облегчает проникновение легкой цепи в цитозоль - внутреннее пространство нейрона.
Будучи высокоспецифичной протеазой, легкая цепь расщепляет белок SNAP-25, необходимый для высвобождения ацетилхолина. В результате SNAP-25 не участвует в процессе слияния везикулы с пресинаптической мембраной; высвобождение нейромедиатора в нервно-мышечный синапс блокируется, что приводит к расслаблению мышцы. Посредством этого механизма ботулинического нейротоксина (БоНТ) блокирует иннервацию холинергическими волокнами поперечнополосатых и гладких мышц, а также иннервацию экзокринных желез. Механизм действия всех препаратов БоНТ идентичен.
Рисунок 2. Блок-схема производства очищенного БоНТ.
б) Производство препаратов ботулинического нейротоксина (БоНТ). Процесс производства состоит из двух этапов: получение лекарственного вещества, или активного фармацевтического ингредиента -высококонцентрированного раствора БоНТ, и изготовление конечного продукта, или готовой лекарственной формы, с помощью значительного разведения, добавления вспомогательных веществ, расфасовки по флаконам и завершающего высушивания.
Получение активного фармацевтического ингредиента всех препаратов начинается с ферментации С. botulinum типа А, образующего анаэробные споры. Особенности процессов ферментации и очищения являются собственностью производителя и не разглашаются. Для производства всех препаратов используется так называемый штамм Hall, первоначально выделенный микробиологом Ivan Clifford Hall. Поскольку он поддерживал рост нескольких штаммов С. botulinum типа А, неизвестно, какой из них является подлинным штаммом Hall.
IncoBTX-A производится из штамма АТСС 3502, который распределяется и контролируется Американским банком типовых культур (American Туре Culture Collection, АТСС). Штамм для получения OnaBTX-A называют «Hall-гипер», поскольку, как утверждается, он вырабатывает высокие титры токсина, но, вероятно, из-за условий ферментации не образует спор. Идентификация штамма Hall, используемого для производства AboBTX-A, не опубликована, и он называется просто «штамм Hall». Похоже, последовательность аминокислот нейротоксина во всех препаратах идентична. Нельзя исключить, что используемый штамм может влиять на качество препарата, продуцируя различные белки. Следовательно, различная чистота препарата может влиять и на пространственную структуру, и на иммунологические свойства (структуру эпитопа) белка БоНТ.
После ферментации биомасса осаждается и экстрагируется нейротоксин. OnaBTX-A затем очищается в ходе поэтапного осаждения этанолом и финального осаждения сульфатом аммония, что приводит к образованию так называемого кристаллического комплекса с м.м. примерно 900 кДа. При производстве AboBTX-A вместо осаждения («кристаллизации») используют хроматографию и диализ, в результате чего получают лекарственное вещество, содержащее полноценные и частично разрушенные комплексообразующие белки и некоторые примеси (флагеллин и clp-протеазу).
Соотношение различных комплексообразующих белков не соответствует ни одному из описанных в литературе комплексов. Это может быть смесь комплексов (300 и 500 кДа), но состав комплекса никогда не публиковался. При производстве IncoBTX-A на этапах хроматографии удаляют комплексообразующие белки и другие примеси, получая в результате чистый нейротоксин. Этапы производства чистого нейротоксина показаны на рисунке 2.
Для получения готового лекарственного средства к разведенной активной субстанции добавляют вспомогательные вещества. Все препараты БоНТ содержат различное количество ЧСА (табл. 1). ЧСА необходим для стабилизации незначительного количества (от пико- до нанограмм) активного вещества. Молекулярное действие ЧСА до конца неизвестно. Считалось, но не подтверждено, что он препятствует адсорбции БоНТ стенками флакона или другими поверхностями. Показано, что добавление хлорида натрия в процессе высушивания при производстве OnaBTX-A приводит к денатурации белка БоНТ и снижению его активности.
Инактивация части БоНТ на этапе высушивания могла бы быть причиной, по которой OnaBTX-A содержит примерно на 50% больше белка БоНТ. Иными словами, 100 Ед готового препарата получаются из 150 Ед активной субстанции. При производстве OnaBTX-A используется вакуумная сушка (низкий вакуум), при которой раствор не замораживается, а только охлаждается. В результате на дне флакона образуется тонкодисперсный порошок. AboBTX-A и IncoBTX-A получают методом лиофилизации (высушивания при замораживании), при которой образуется рыхлый осадок.
Рисунок 3. Присутствие ботулотоксина в комплексах после восстановления препаратов. Препараты восстанавливали физраствором, размер комплекса определяли методом скоростной седиментации и последующим иммунным анализом ботулотоксина и комплексообразующих белков.
б) Комплексы и комплексообразующие белки. OnaBTX-A и AboBTX-A содержат БоНТ с м.м. 150 кДа, а также другие белки, называемые комплексообразующими. Утверждается, что эти белки образуют с БоНТ комплекс, способный влиять на его фармакологические свойства. Комплекс вызывает гемагглютинацию (не нужную при терапии БоНТ), поэтому некоторые белки с различной молекулярной массой называют гемагглютининами: НА50, НА34, НА20 и НА17 (в литературе встречаются разные названия, например НА34 то же, что и НАЗЗ). Кроме того, непосредственно с БоНТ связан нетоксичный негемагглютининовый белок NTNH (nontoxic non-hemagglutinating protein).
В кислой среде (pH около 5) все эти белки образуют с нейротоксином с м.м. 150 кДа комплекс, который защищает его от разрушения в желудочно-кишечном тракте (под влиянием низкого pH и действия протеаз) и таким образом способствует его токсичному действию. Гемагглютинины также играют важную роль при всасывании БоНТ из желудочно-кишечного тракта. Будучи лектинами (белками, связывающими углеводы), они могут связываться с Е-кадгерином и способствовать проникновению БоНТ через слизистую оболочку кишечника и его транспорту в кровь или лимфу.
Из культур С. botulinum типа А выделены три комплекса - предшественника БоНТ с м.м. 900, 500 и 300 кДа19. Утверждается, что м.м. комплекса OnaBTX-А составляет 900 кДа (табл. 1). Составы комплексов, присутствующих в AboBTX-A, не опубликованы, но данные свидетельствуют о наличии в них как полноразмерных комплексообразующих белков, так и последовательности их фрагментов. Поскольку основная часть NTNH, присутствующего в AboBTX-A, представляет собой усеченный белок, можно сделать вывод о небольшом количестве или отсутствии комплексов 500 и 900 кДа и о том, что, вероятно, комплекс 300 кДа самый многочисленный.
Для идентификации комплексов в готовом препарате после восстановления его анализируют методом ультрацентрифугирования для разделения белков и комплексов различных размеров. Согласно полученным данным, сразу после восстановления ОпаВТХ-А ботулотоксин отделяется от комплекса и до введения в ткани-мишени более 85% БоНТ с м.м. 150 кДа находится в свободном виде (рис. 3). Что касается AboBTX-A, то еще до инъекции ботулотоксин полностью отделялся от комплексообразующих белков. Можно сделать вывод, что молекулярная масса или размер белкового комплекса не влияют на биологическую активность и фармакологические свойства, поскольку после восстановления препарата БоНТ-А ботулотоксин быстро отделяется от комплексообразующих белков.
Рисунок 4. Определение распространения препаратов БоНТ с комплексообразующими белками и без них в исследовании на половине лица. Добровольцам внутримышечно в область лба было введено 5 Ед OnaBTX-A (левая сторона) или 5 Ед IncoBTX-A. Через 6 нед. выполнили йодокрахмальный тест.
г) Благоприятна ли роль комплексообразующих белков. В первые годы применения БоНТ в лечебных целях считалось маловероятным, что в клинической практике когда-нибудь будет использоваться чистый БоНТ, поскольку он «инактивируется при разведении, изготовлении лекарственной формы и высушивании». Это утверждение было опровергнуто после регистрации в Германии IncoBTX-А - ботулотоксина, свободного от комплексообразующих белков и самого стабильного из всех препаратов БоНТ.
Хотя комплексообразующие белки не участвуют в механизме действия, считалось, что они влияют на диффузию, или распространение БоНТ из места введения в соседние, не подлежащие обработке мышцы. В связи с высоким сродством к холинергическим нейронам (мотонейронам и некоторым нейронам, активирующим железы, например потовые и слюнные) все связанные с лечением БоНТ побочные эффекты вызваны его миграцией в мышечной ткани.
Дискуссии по поводу распространения и диффузии БоНТ осложнены отсутствием единой терминологии. Распространение токсина происходит при его миграции из места введения и зависит от техники инъекции, объема введенного препарата, калибра иглы и размера молекулы. Диффузия же представляет собой пассивный транспорт БоНТ в жидкости противоположно направлению вектора градиента концентрации. Согласно закону Фика, скорость диффузии обратно пропорциональна молекулярной массе, т.е. молекула с высокой молекулярной массой перемещается медленнее, чем с низкой. Можно предположить, что комплекс с м.м. 900 кДа останется в мышце дольше, чем БоНТ, не связанный с комплексообразующими белками, и, возможно, приведет к более низкой частоте побочных действий на удаленные участки.
Однако это не подтверждается клинической практикой, и характер побочных явлений во всех прямых сравнительных исследованиях OnaBTX-A и IncoBTX-A очень схожий.
Недавние исследования, сравнивающие распространение препаратов БоНТ-А с помощью измерения участка пониженного потоотделения после введения пациентам идентичных объемов и эквивалентных доз в область лба, показывают похожее распространение. Предполагается, что никаких различий в миграционных свойствах нет. Сравнение применения OnaBTX-A и AboBTX-A в соотношениях доз 1:2,5, 1:3 и 1:4 показало, что при всех соотношениях и равных введенных объемах в 93% случаев участок пониженного потоотделения был меньше после введения AboBTX-A. Отдельное исследование соотношения доз 1:2,5 не выявило статистически значимой разницы между средним размером участков гипергидроза после использования двух препаратов. При введении препаратов в эквивалентных дозах и в одной и той же технике никаких различий в распространении не было.
Причина, по которой комплексообразующие белки не влияют на миграцию БоНТ в ткани, очень проста: на момент введения пациенту они уже отделены от молекулы БоНТ. Даже если в мышцу попадет интактный комплекс, он мгновенно диссоциирует, не будучи стабильным при значении pH, равном 7,3. Подобные свойства продемонстрированы в клиническом исследовании внутримышечного введения добровольцам в 2 точки лба эквивалентных доз в одном и том же объеме OnaBTX-A и IncoBTX-A (5 Ед) или AboBTX-A (12,5 Ед) (тест на половине лица). Через 6 нед., а затем через 6 мес. на проблемном участке гипергидроза выполняли йодокрахмальный тест (рис. 4).
Размеры участков, обработанных OnaBTX-A и IncoBTX-A, были схожи, это свидетельствует о том, что комплексообразующие белки не влияют на распространение токсина. Область, обработанная AboBTX-A, была больше, что, возможно, связано с соотношением применяемых доз. Эти данные подтверждены доклиническим исследованием на мышах, в ходе которого распределение токсина визуализировали, анализируя экспрессию белка N-САМ, который накапливается и определяется только в денервированной мышце. Результаты не выявили никакой разницы между препаратами. Можно сделать вывод о том, что после введения всех препаратов БоНТ токсин свободно мигрирует и в равной степени распространяется за пределы места инъекции.
Исходя из того, что комплексообразующие белки защищают БоНТ от влияния окружающей среды, было высказано предположение, что они необходимы для поддержания стабильности препаратов БоНТ при хранении. Но тогда у IncoBTX-A период стабильности должен быть короче или условия хранения строже, чем у других препаратов. Однако это не так. Срок годности IncoBTX-A составляет 3 или 4 года при комнатной температуре, AboBTX-A - 2 года при 2-8°С и OnaBTX-A - 2 или 3 года при 2-8°С (в зависимости от количества единиц) или в морозильной камере. После восстановления IncoBTX-A и OnaBTX-A стабильны в течение 24 ч при 2-8°С, AboBTX-A - в течение 4 ч при 2-8°С. В недавнем исследовании сравнивали эффективность IncoBTX-A, восстановленного непосредственно перед инъекцией, и IncoBTX-A, восстановленного и хранившегося в течение 1 нед. при 25°С.
Рисунок 5. Стабильность IncoBTX-A при 25°C.
Полученные результаты стали дополнительным подтверждением стабильности IncoBTX-А. В ходе исследования на половине лица 21 пациенту в морщины «гусиные лапки» было введено по 10 Ед каждого препарата. В течение более 4 мес. не наблюдалось никакой статистически значимой разницы в эффективности свежего и хранившегося препаратов или в устойчивости полученных результатов. Длительный срок годности и менее строгий температурный режим хранения IncoBTX-A (табл. 1, рис. 5) свидетельствуют о том, что стабильность БоНТ не обусловлена наличием комплексообразующих белков. Также показано, что хранение IncoBTX-A в течение 4 нед. при 60°С не приводит к его инактивации.
д) Активность и клиническая эффективность. Активность препаратов БоНТ измеряется при определении LD50 и выражается в единицах. За одну единицу принимается доза, способная вызвать гибель 50% мышей по сравнению со стандартным препаратом БоНТ, который также анализируется при каждом тестировании (параллельный анализ). Терапевтическая доза соотносится с единицами LD50, и поэтому необходимо тщательное определение LD50. Каждый производитель использует собственное тестирование, отличающееся по методу разведения, растворителям и стабилизирующим веществам: ЧСА (IncoBTX-A), желатин (AboBTX-A) или отсутствие стабилизатора (OnaBTX-A).
Поскольку определение единиц зависит от методов, используемых производителями в ходе нестандартизированного анализа, сравнивать активности препаратов только на основе единиц проблематично. Поэтому для оценки эффективности лечения так важны прямые клинические исследования. Примечательно, что тестирование активности IncoBTX-A с использованием в качестве растворителя ЧСА и в сравнительных клинических исследованиях показало, что для препаратов IncoBTX-A и OnaBTX-A возможно применять коэффициент пересчета 1:1. Производитель OnaBTX-A использует одобренную в разных странах линию чувствительных нейронных клеток SiMa, а производитель IncoBTX-A недавно получил одобрение FDA на тестирование на дифференцированных плюрипотентных стволовых клетках.
Оба метода оценивают количество расщепленного SNAP-25, однако должны быть всесторонне проверены, прежде чем заменят испытания на животных. Было бы интересно оценить препараты БоНТ обоими методами.
Содержание БоНТ в 100 Ед, измеренное с помощью высокочувствительного метода ELISA, составило 0,73 нг для OnaBTX-A, 0,65 нг - для AboBTX-A и 0,44 нг - для IncoBTX-A (табл. 1). Удельная активность БоНТ, или биологическая активность (Ед) на единицу массы белка БоНТ, была рассчитана исходя из общей средней концентрации нейротоксина БоНТ-А. Наивысшей удельной активностью (Ед/нг ботулотоксина) обладает IncoBTX-A - 227 Ед/нг. Для OnaBTX-А она составляет 137 Ед/нг, для AboBTX-A - 154 Ед/нг. IncoBTX-A не содержит клостридиальных белков, поэтому его удельная биологическая активность относительно общего количества клостридиальных белков составляет 227 Ед/нг.
Поскольку в 100 Ед OnaBTX-А содержится 5 нг клостридиального белка, а в 100 г AboBTX-A - 4,35 нг, эквивалентная удельная активность относительно общей клостридиальной протеиновой нагрузки для OnaBTX-А составляет 20 Ед/нг, а для AboBTX-A -115 Ед/нг. Единицы AboBTX-A отличаются от единиц OnaBTX-A и IncoBTX-A. Однако, сравнивая препараты OnaBTX-А и IncoBTX-A, показавшие схожее клиническое действие, можно предположить, что 0,44 нг IncoBTX-A обладают той же биологической активностью, что и 0,73 нг OnaBTX-A. Предполагается, что часть ботулотоксина OnaBTX-A может быть инактивирована или денатурирована в ходе вакуумной сушки, используемой при получении готового препарата в присутствии хлорида натрия.
Рисунок 6. Количество клостридиальных белков и белка БоНТ при коррекции глабеллярных морщин.
На рисунке 6 показано количество клостридиального белка и белка БоНТ, введенного пациенту при коррекции глабеллярных морщин вместе с 20 Ед OnaBTX-A или IncoBTX-A либо 50 Ед AboBTX-A. Пациенты, леченные препаратами, содержащими комплексообразующие белки, получают большее количество бактериального протеина; при использовании OnaBTX-A оно в 10 раз больше.
Комплексообразующие белки не влияют на механизм действия БоНТ. Только БоНТ свободно и независимо от любых других компонентов связывается с ганглиозидами (GT1b) и белковым рецептором (SV2) холинергических нейронов, захватывается эндосомами, а затем его легкая цепь проникает в цитозоль нервной клетки. Ни один из этапов механизма действия не требует участия других белков. Хотя в качестве активного вещества все препараты содержат БоНТ, ведутся споры о сопоставимости их биологической активности.
Рисунок 7. Прямое исследование сравнимой эффективности IncoBTX-А (Bocouture) и OnaBTX-A (Vistabel) при коррекции глабеллярных морщин. Результат инъекций оценивал независимый специалист через 4 и 12 нед.
Рисунок 8. Прямое сравнительное клиническое исследование IncoBTX-A и OnaBTX-A при коррекции морщин «гусиные лапки». Проспективное перекрестное двойное слепое исследование на половине лица в течение двух последовательных курсов коррекции с введением 12 Ед IncoBTX-A или OnaBTX-A и 6-месячным «периодом отмывки» между курсами. График иллюстрирует сводные результаты циклов 1 и 2 в виде среднего балла выраженности морщин на обеих половинах лица при максимальном сокращении мышц для IncoBTX-A и OnaBTX-A.
Несколько прямых клинических исследований IncoBTX-A и OnaBTX-A при различных эстетических показаниях (глабеллярные морщины, «гусиные лапки») показали сравнимую клиническую эффективность препаратов. В ходе исследований был предложен коэффициент пересчета препаратов 1:1 (рис. 7). Также было отмечено отсутствие различий в отношении побочных явлений. В недавнем перекрестном клиническом исследовании на половине лица была подтверждена сравнимая эффективность OnaBTX-A и IncoBTX-A в одинаковой дозе при коррекции «гусиных лапок» (рис. 8). Кроме того, в другом сравнительном исследовании OnaBTX-A, IncoBTX-A и AboBTX-A при коррекции межбровных морщин устойчивость результата была одинаковой независимо от введенного препарата. Доказательства, подтверждающие правомерность коэффициента пересчета 1:1 для OnaBTX-A и IncoBTX-A, приведены в нескольких, основанных на фактических данных, обобщенных обзорах применения БоНТ-А по эстетическим показаниям.
Коэффициент пересчета для AboBTX-A и OnaBTX-A или IncoBTX-A все еще обсуждается и окончательно не определен. В недавнем обобщенном обзоре предполагается, что для эстетических показаний может быть принят коэффициент пересчета 1:2,5 (IncoBTX-A:AboBTX-A). Корейские авторы предлагают для пациентов из стран Азии использовать соотношение 1:2-1:4 (OnaBTX-A:AboBTX-A). RimaBTX-B на основе комплекса БоНТ-B не одобрен для эстетических показаний, и коэффициент пересчета для IncoBTX-A и RimaBTX-B не опубликован.
