МедУнивер - MedUniver.com Все разделы сайта Видео по медицине Книги по медицине Форум консультаций врачей  
Рекомендуем:
Дерматология:
Дерматология
Основы дерматологии
Опухоли кожи
Болезни волос
Болезни кожи детей
Болезни кожи взрослых
Болезни кожи новорожденного
Болезни ногтей
Инфекции кожи и подкожной клетчатки
Пигментные пятна - меланозы
Родинки - невусы
УЗИ в дерматологии
Косметология:
Ботулотоксин в медицине
Инъекции филлеров
Пилинг лица и шеи
Пластическая хирургия лица и шеи
Подология
Уход за волосами
Уход за лицом
Уход за телом
Уход за ногтями
Косметика и макияж
Советы косметолога
Форум
 

Структура и механизм действия (фармакология) ботулотоксина

Подобно таким натуральным веществам, как дигиталис, атропин и зиконотид, ботулотоксины стали лекарственными средствами. В отличие от традиционных синтетических медикаментов, ботулотоксины представляют собой белки, вырабатываемые живыми организмами, - бактериями рода клостридии (Clostridium). Для клинического использования ботулотоксины выделяют, очищают и преобразуют в конкретные препараты. Это сложный многоэтапный процесс, строго регламентируемый государственными учреждениями большинства стран, в которых одобрены данные препараты. От технологии производства зависит не только чистота конечного продукта, но и воспроизводимость единицы активности - меры дозы БоНТ. Также очень важен окончательный состав препарата, способный повлиять на его стабильность, эффективность, безопасность и иммуногенность.

а) Синтез и структура. БоНТ синтезируется в виде многомерных белковых комплексов, состоящих из нейротоксина с молекулярной массой (м.м.) примерно 150 кДа и гемагглютининовых и негемагглютининовых белков. Эти комплексообразующие белки (neurotoxin associated proteins, NAP) стабилизируют и защищают нейротоксин от разрушения в желудочно-кишечном тракте, а также обладают соответствующей биологической активностью in vivo, о чем свидетельствует различие фармакодинамических кривых после внутрибрюшинного и внутривенного введения мышам БоНТ с м.м. 150 и 900 кДа. На взаимодействие белков БоНТ и комплексообразующих белков влияет микроокружение, включая значение pH, но исследовать эти процессы после введения препарата людям гораздо сложнее. При изготовлении БоНТ-А для клинического применения производители используют собственные методы определения комплексообразующих белков в конечном препарате.

Разные бактериальные штаммы синтезируют комплексы, отличающиеся по размеру, белковому составу и серотипу нейротоксина. Различают семь серотипов БоНТ: А, В, C1, D, Е, F и G. Серотипы A-F образуют комплексы с м.м. 300 кДа; серотипы А, В, С1 и D - с м.м. 500-700 кДа, и только тип А образует комплекс с м.м. 900 кДа. Серотип G образует комплекс с м.м. 500 кДА. Некоторые штаммы клостридий содержат мозаичные гены, кодирующие части двух разных серотипов; например, вновь обнаруженный БоНТ может быть или новым серотипом Н, или гибридом типов А и F. Ранее были описаны гибриды типов С1 и D и существование гибридов у типов F и А. Определены также разновидности токсина в пределах серотипов (например, A1, А2 и т.д.) и представлены результаты их доклинических исследований in vivo.

Все серотипы продуцируют БоНТ в виде одиночной цепочки с м.м. примерно 150 кДа, которая активируется разрывом или расщеплением протеазами (рис. 1). В результате образуется молекула, состоящая из тяжелой (м.м. примерно 100 кДа) и легкой (м.м. около 50 кДа) цепей, соединенных дисульфидным мостиком. Белок содержит четыре домена: легкую цепь (~50 кДа) и три домена в составе тяжелой цепи - мембранный транслокационный домен HN (~50 кДа), каталитический домен HCN (~25 кДа) и связывающий домен НCC (~25 кДа).

Структура и механизм действия (фармакология) ботулотоксина
Рисунок 1. Схематичное изображение структуры активированной двухцепочечной молекулы БоНТ (100 и 50 кДа) (а) и диаграммы кристаллической структуры ботулотоксина типа А1 (БоНТ-A1) (b-d). Четыре белковых домена взаимодействуют с белковыми и липидными компонентами клеточной мембраны, облегчая интернализацию БоНТ: домен НC специфично взаимодействует с нервными окончаниями посредством фрагмента НCC, связывающего ганглиозиды, и домена HCN, возможно связывающего фосфатидилинозитолфосфат, домен HN образует в эндосоме канал, по которому L-цепь проникает в цитозоль нервных окончаний. Обладая металлопротеиназной активностью, L-цепь расщепляет один или несколько белков комплекса SNARE (растворимого N-этилмалеимид-чувствительного фактора, осуществляющего слияние белка и рецептора), участвующих в высвобождении нейромедиатора из везикулы. Пептидный пояс (темно-синий) охватывает L-домен и дисульфидный мостик (оранжевый) и связывает L-цепь с доменом HN.

б) Фармакологическое действие:

1. Общий механизм действия. Действие БоНТ - это многоэтапный процесс, включающий связывание токсина с нервными окончаниями, интернализацию, проникновение легкой цепи через эндосомальную мембрану и ингибирование высвобождения нейромедиатора из синаптических везикул. В этой главе рассматриваются современные сведения о механизме действия БоНТ; дополнительная информация представлена в обзорах.

2. Связывание. При связывании с мембранами нервных клеток БоНТ взаимодействует с липидными и белковыми компонентами клеточной мембраны, что облегчает его интернализацию. Процесс связывания объясняется с помощью модели мультирецептора, в которой корецептор содержит ганглиозид и белковый компонент. БоНТ взаимодействует с ганглиозидами, содержащимися в большом количестве на пресинаптических терминалях. Считается, что ганглиозиды опосредуют начальный низкоаффинный контакт БоНТ с мембраной нервной клетки. Связывание с ганглиозидами повышает локальную концентрацию БоНТ на поверхности мембраны, что позволяет ему диффундировать в мембранный слой и связываться со своим специфическим высокоаффинным белковым рецептором (рис. 1, 2).

Структура и механизм действия (фармакология) ботулотоксина
Рисунок 2. Связывание и проникновение БоНТ внутрь нервных окончаний. Карбоксильный конец домена HN (домен НC-C) связывается с полисиалоганглиозидом (PSG), присутствующим на пресинаптической мембране, а затем с белком (либо синаптотагмином [Syt], либо синаптическим везикулярным протеином 2 [SV2]), находящимся в синаптической везикуле или на пресинаптической мембране (этап 1). Кристаллическая структура ботулотоксина типа В (БоНТ-B), связанного с Syt и PSG, изображена в левой нижней части рисунка, кристаллическая структура БоНТ-А, связанного с PSG и SV2, - в правой нижней части. Затем БоНТ захватывается путем эндоцитоза синаптическими везикулами (этап 2) с помощью Na+, К+-АТФазы, которая регулирует процесс обратного захвата нейромедиатора. Поскольку внутренняя среда везикулы кислая, происходит протонирование БоНТ, приводящее к выходу L-цепи через везикулярную мембрану (этап 3) в цитозоль. Транслокация может осуществляться и через эндосомальную мембрану после слияния синаптической везикулы с эндосомой (что, по-видимому, происходит в культивируемых нейронах). После разрыва дисульфидной связи (S-S; оранжевый цвет) L-цепь отделяется от домена HN. Обладая металлопротеиназной активностью, L-цепь серотипов В, D, F и G расщепляет VAMP, серотипов А и Е -SNAP-25, а L-цепь серотипа С расщепляет и SNAP-25, и синтаксин (этап 4), что приводит к блокаде высвобождения нейромедиатора.

БоНТ-А связывается с ганглиозидами посредством не только домена НCC, но и фрагментов домена HN (аминокислотными остатками HN729-845). В домене НC всех исследованных к настоящему времени серотипов, за исключением серотипа D, была обнаружена консервативная последовательность сайта связывания ганглиозидов, но степень сродства к разным ганглиозидам различается между серотипами и внутри серотипов (например, A1, А2 и т.д.), продуцируемых разными штаммами клостридий. Обладает ли такой функцией и домен HCN, неизвестно, но, возможно, он участвует в связывании фосфатидилинозитолфосфата.

SV2 служит белковым рецептором для БоНТ типов A, C1, D, Е и F и локализуется в синаптических везикулах. Во время экзоцитоза порция белков SV2 выходит в цитоплазму, образуя места связывания для фиксации БоНТ. Существует по крайней мере три изоформы SV2 (SV2A, SV2B и SV2C), связывающие несколько серотипов БоНТ с различным сродством (табл. 1).

Структура и механизм действия (фармакология) ботулотоксина

Синаптотагмины I и II - белковые рецепторы для БоНТ типов В и G - локализуются на мембранах синаптических везикул, где при участии ионов кальция запускают слияние везикулы. Связываясь с этими белками, БоНТ типов В и G проникает в нейроны.

Показано, что С-концевой домен БоНТ гомологичен факторам роста фибробластов, а рецептор фактора роста фибробластов 3 (FGFR3) способен выступать в роли дополнительного белкового рецептора в клетках нейробластомы. Однако значение этого связывания in vivo еще неизвестно.

Структура и механизм действия (фармакология) ботулотоксина
Рисунок 3. Модель молекулярных взаимодействий при транслокации L-цепи через мембрану синаптической везикулы. Закисление везикулы под действием Na+, К+-АТФазы вызывает конформационное изменение в домене HN, что позволяет ему проникнуть в липидный бислой. Это приводит к образованию канала, по которому частично развернутая L-цепь проходит сквозь мембрану. Предполагается, что дисульфидная связь (S-S) обеспечивает прохождение L-цепи через мембрану на позднем этапе транслокации, а ее разрыв на цитозольной стороне мембраны синаптической везикулы высвобождает L-цепь в цитозоль.

3. Интернализация и транслокация. После связывания с ганглиозидами и белковыми корецепторами БоНТ с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза проникает в эндосому/везикулу. Этапы прохождения легкой цепи через везикулярную мембрану все еще исследуются; недавно полученные данные подтверждают следующий механизм (рис. 3). Na+, К+-АТФаза закачивает в просвет везикулы протоны, тем самым понижая значение интравезикулярного pH. Кислая среда эндосомы вызывает конформационные преобразования комплекса «нейротоксин-рецептор», что способствует внедрению тяжелой цепи в эндосомальную мембрану. Домен HN тяжелой цепи формирует канал, а домен НC способствует тому, чтобы легкая цепь раскрутилась и по каналу проникла в цитозоль. Дисульфидная связь между тяжелой и легкой цепями необходима для прохождения через мембрану синаптической везикулы, но в итоге она разрывается, позволяя легкой цепи отделиться и взаимодействовать с SNAP-25.

4. Ферментативная активность. Внутри цитозоля легкая цепь каждого серотипа, обладающая цинк-зависимой протеазной активностью, расщепляет специфическую пептидную связь в одном или нескольких белках SNARE, необходимьгх для докинга и слияния везикулы (рис. 4).

Несмотря на то что мишенью для серотипов А и Е является один и тот же белок - SNAP-25, его расщепление происходит в разных участках, вследствие чего длительность паралитического действия у серотипа Е существенно меньше, чем у серотипа А. Данные показывают, что легкая цепь серотипа А и его продукт расщепления (SNAP-25197) локализуются на плазматической мембране, тогда как легкая цепь серотипа Е распределяется по всей цитоплазме клетки. Локализация легкой цепи серотипа А на плазматической мембране уменьшается после мутации дилейцинового мотива. Мутация по дилейциновой последовательности серотипа А приводит также к быстрому восстановлению нервно-мышечной функции у крыс45. Недавно обнаружено, что мутация по двум лейцинам препятствует взаимодействию легкой цепи с септинами - внутриклеточными структурными белками, группирующимися с легкой цепью на плазматической мембране (рис. 5), а также ускоряет разрушение легкой цепи БоНТ-А.

Структура и механизм действия (фармакология) ботулотоксина
Рисунок 4. Механизм действия ботулинического нейротоаксина А (БоНТ-A): доставка синаптическими везикулами нейромедиаторов, мембранных каналов и рецепторов: (а) Транспортировка синаптической везикулой (СВ) своего содержимого (например, нейромедиаторов) и билипидной мембраны с ионными каналами и рецепторами. СВ образуют в нервном окончании резервный пул и могут содержать нейромедиаторы. На поверхности большинства СВ присутствуют несколько белков: мембраноассоциированные белковые рецепторы, ванилоидные (TRPV1) и анкириновые рецепторы (TRPA1) из семейства TRP-рецепторов - ионных каналов с транзиторным рецепторным потенциалом. СВ фиксируются на нервном окончании и активной зоне внутренней мембраны, и начинается АТФ-зависимый этап прайминга, в ходе которого в ответ на повышение концентрации Са2+ запускается слияние, экзоцитоз и последующая доставка во внеклеточное пространство не только содержимого СВ, но и липидной мембраны и с белками на поверхность клетки. Для успешного слияния требуется взаимодействие находящегося на мембране везикулы белка VAMP/синаптобревина с расположенными на внутренней мембране белком SNAP-25 с м.м. 25 кДа и синтаксином. В результате образуется комплекс SNARE. В процессе участвуют, но не изображены, и другие белки (например, Muncl8, Rab)41. Мембрана СВ может полностью слиться с терминальной мембраной (полное разрушение и слияние), доставляя таким образом белковые рецепторы (например, TRPV1 или TRPA1) на поверхность клетки. Дополнительный цикл посредством одного из способов эндоцитоза не показан. ОпаВТХ-А расщепляет SNAP-25, препятствуя слиянию СВ и регулируемой доставке рецепторов TRPV1 или TRPA1 к терминальной мембране, снижая тем самым активность рецепторов. Для наглядности СВ с содержимым и липидным бислоем изображены схематично. (b) Механизм действия ОпаВТХ. (А) тяжелая цепь OnaBTX-А связывается с акцепторным комплексом, состоящим из трех компонентов: ганглиозида GT1b, SV2 и рецептора фактора роста фибробластов 3 (FGFR3); (В) интернализация в эндосому и (С) закисление содержимого; (D) конформационное изменение, позволяющее легкой цепи пройти сквозь мембрану эндосомы; (Е) в цитозоле легкая цепь специфически расщепляет SNAP-25 (м.м. 25 кДа), один из реципиентов SNARE-комплекса, необходимых для стыковки СВ с мембраной; (F) расщепление SNARE препятствует слиянию СВ с терминальной мембраной. Это блокирует доставку содержимого СВ (нейромедиаторов) в синаптическую щель, а также доставку карго и экспрессию на поверхности клеток соответствующих рецепторов периферических нервов и ионных каналов.
Структура и механизм действия (фармакология) ботулотоксина
Рисунок 5. Субклеточная локализация легкой цепи в дифференцированных клетках феохромоцитомы крыс (РС12). Зеленый флуоресцентный белок - легкая цепь серотипа A (GFP-LCA), расположенная точечно в определенных областях на плазматической мембране тела клетки и аксонов без флуоресценции в цитоплазме клеток (a). GFP-LCE (b), наоборот, точечно локализуется в цитоплазме клетки, a GFP-LCB (с) распространяется по всей клетке, включая ядро.

Легкая цепь серотипа Е, наоборот, не взаимодействует с септинами. Эти данные свидетельствуют о том, что кластеризация легкой цепи БоНТ-А с септинами на плазматической мембране за счет взаимодействия с дилейциновым мотивом имеет решающее значение для ее стабильности; эти свойства значительно продлевают действие БоНТ при клиническом применении. БоНТ-А - единственный серотип, содержащий дилейциновую последовательность на С-терминальном конце легкой цепи.

В условиях эксперимента in vitro связывание и интернализация БоНТ происходят в течение нескольких минут, а протеолиз SNAP-25 может быть выявлен в течение 30 мин. Хотя из-за способности вызывать генерализованное ослабление мышц БоНТ традиционно называют нейротоксином, он не обладает цитотоксичностью.

5. Клиническая фармакология. Универсальный процесс SNARE-опосредован-ного транспорта синаптических везикул является фармакологической мишенью действия БоНТ в нейронах, способных связывать и интернализировать токсин.

в) Отсутствие ретроградного транспорта при соответствующих дозах, используемых в доклинических исследованиях. Основная разница между столбнячным токсином и БоНТ заключается в том, что первый оказывает действие на нервную систему посредством ретроградного транспорта и проникновения в нейроны посредством трансцитоза, а второй - нет. Примечательно, что столбняк приводит к спастическому параличу, а БоНТ - к расслаблению периферических мышц. Однако за последние 10 лет появилось несколько сообщений о ретроградном транспорте БоНТ-А в условиях эксперимента, что, кажется, противоречит этому различию.

В отличие от сравнительно низких доз, используемых в клинической практике, при исследованиях, выявивших ретроградный транспорт и трансцитоз, применяли очень высокие локальные дозы БоНТ. Например, Antonucci с соавт. вводили в 1 точку подушечки усов крысы большую дозу лабораторного препарата БоНТ-А (135 пг), что составляло примерно 450 пг/кг. Для сравнения -пациентам для коррекции морщин лица обычно вводят около 20 Ед (или 3 пг/кг) ОпаВТХ-А в несколько мышц, что в пересчете на килограмм массы тела примерно в 150 раз ниже дозы, используемой Antonucci с соавт..

Dolly с соавт. провели исследование дозозависимого эффекта, которое позволило прояснить значение ретроградного транспорта. Авторы использовали культуру разделенных симпатических нейронов крысы и добавляли к аксонам БоНТ в пикомолярных (пмоль) концентрациях. Транспорт БоНТ в тело клетки измеряли как процент расщепленного SNAP-25 от его общего количества. Результаты показали, что, за исключением больших доз, БоНТ-А действовал локально; например, добавление 10 пмоль БоНТ-А к аксонам привело к расщеплению примерно одной трети общего SNAP-25, но фактически в телах клеток расщепленного SNAP-25 не было. Авторы отмечают, что такое количество БоНТ-А эквивалентно 75 мышиным LD50 и на 50% выше максимальной рекомендуемой для введения в одну точку клинической дозы, равной 50 Ед. При введении в дистальные аксоны в дозе 104 пмоль, в 1000 раз превышающей клиническую (~10 пмоль), БоНТ вызывал расщепление SNAP-25 в центральном компартменте (что указывает на некоторый ретроградный транспорт), но не блокировал синаптическую передачу в клеточных телах и потому не оказывал никакого функционального действия. Трансцитоза в ходе исследований не отмечалось.

Получить дополнительные сведения помогло недавнее исследование с применением высокоселективных антител к расщепленному БоНТ-А субстрату (SNAP-25197) в сочетании с 3D-визуализацией. После введения низкой дозы в заднюю конечность крысы SNAP-25197 локализовался в мотонейронах; при более высокой дозе в периферических мышцах и соответствующих участках спинного мозга наблюдалось спорадическое окрашивание, указывающее на системное, но ограниченное мотонейронами распространение токсина. Никаких свидетельств трансцитоза не было.

г) Заключение и выводы. Ботулинический нейротоксин (БоНТ) продолжают стимулировать фундаментальные и клинические исследования. За прошедшие несколько лет сообщалось о достижениях в понимании механизмов связывания и интернализации БоНТ, появляется больше подробной информации о протеиновых доменах и их взаимодействиях с белковыми и липидными компонентами плазматической мембраны. Механизмы действия, отличные от угнетения высвобождения ацетилхолина из нейронов, также являются активной областью исследований. Их существование подтверждается эффектами OnaBTX-A на афферентные/сенсорные механизмы, которые наблюдаются при лечении хронической мигрени и заболеваний мочевыводящих путей.

Кроме лечения гипергидроза и коррекции морщин лица проводятся клинические исследования применения БоНТ-А при многих кожных заболеваниях. Первые результаты этих небольших исследований показывают, что БоНТ-А может сокращать выработку себума, замедлять образование рубцовой ткани, улучшать внешний вид келоидных рубцов. Что касается исследований и дальнейшего развития, вероятно, этим важным, но невзаимозаменяемым белкам будут найдены новые сферы применения.

- Также рекомендуем "Механизм действия ботулотоксина при нервно-мышечных заболеваниях (клиническая фармакология)"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 24.8.2022

Медунивер Мы в Telegram Мы в YouTube Мы в VK Форум консультаций врачей Контакты, реклама
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.