а) Структура зубных биопленок. Ранние исследования с использованием электронной микроскопии дали важную информацию о структуре зубного налета с различных участков и продемонстрировали существование биопленок, содержащих микроорганизмы нескольких морфологических типов, часто компактно расположенные. Совсем недавно вошла в употребление конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, которая не требует такой обработки образца, как для электронной микроскопии, и поэтому образцы можно увидеть в их естественном, гидратированном состоянии.
При конфокальной микроскопии получают оптические срезы биопленки, после чего производят 3D-реконструкцию с помощью соответствующего программного обеспечения. Использование конфокальной микроскопии подтвердило, что зубной налет также может иметь открытую архитектуру, подобно биопленкам из других мест. В пределах биопленки наблюдаются каналы, хотя они также могут содержать экзополимеры (Wood et al., 2000; Auschill et al., 2001). Различные методы микроскопии могут быть также объединены с новыми методами окрашивания, что в совокупности дает более подробную информацию о составе и организации этих биопленок.
К примеру, использование красителей, по-разному окрашивающих живые и мертвые клетки, показало, что бактериальная жизнеспособность различна в разных частях биопленки — от наиболее жизнеспособных бактерий, присутствующих в центральной ее части, до пустот и каналов у ее границы (Auschill et al., 2001). Такое достаточно открытое строение биопленки позволяет молекулам легко входить в зубной налет и выходить из него. Однако благодаря матриксу, состоящему из разнообразных экзополимеров, формируется сложная среда, не позволяющая точно прогнозировать проникновение и распределение молекул в пределах зубного налета (Robinson et al., 1997; Thurnheer et al., 2003; Marcotte et al., 2004), в том числе средств по уходу за полостью рта и терапевтических препаратов. Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH — от англ. Fluorescent in situ hybridization), в которой флюоресцентный зонд сочетается с олигонуклеотидным, специфичным для конкретного организма, может показать расположение этих микроорганизмов, в том числе некультивируемых видов, в пределах биопленки (Marsh et al., 2011; Zijnge et al., 2010) (рис. 7).
Рисунок 7. Образцы поддесневых биопленок с различными оральными видами, обнаруженными при флюоресцентной гибридизации in situ: а — в кластере из Fusobacterium spp. (пурпурный) и Prevotella intermedia (желтый); б — некультивируемые спирохеты (оранжевый) и Fusobacterium spp. (светло-синий).
Наддесневые биопленки зубного налета оказались весьма неоднородны по структуре при просмотре с использованием FISH-зондов, предназначенных для ряда бактериальных видов (Zijnge et al., 2010). Поддесневой зубной налет имеет еще более сложную архитектуру. Первоначальные исследования с использованием обычного светового микроскопа выявляли различия в биопленках, ассоциированных с зубами и с эпителием, с возможно менее плотной зоной микроорганизмов во втором случае (Socransky & Haffajee, 2002). Соадгезия считается важным фактором во временном и пространственном развитии поддесневых биопленок.
Многие из предполагаемых патогенов, которые могут быть найдены в поддесневых зубных отложениях, в здоровом пародонте присутствуют в небольших количествах и сохраняются, прикрепившись к ранним стрептококковым и актиномицетовым колонизаторам (Kuboniwa & Lamont, 2010). Эти развивающиеся сложные микробные сообщества, чтобы выжить, участвуют в многочисленных метаболических взаимодействиях.
В последнее время обследовали поддесневые биопленки непосредственно на удаленных зубах, кроме того, идентификацию и расположение бактерий исследовали с использованием FISH (Zijnge et al., 2010). Было показано, что у поддесневых биопленок сложное строение, в них можно выделить четыре слоя. Базальный слой состоит из палочковидных организмов (Actinomyces spp.), прикрепленных перпендикулярно к поверхности зуба, над ним промежуточный слой, состоящий из множества веретенообразных клеток, в том числе F. nucleatum и Tannerella forsythia. В верхнем слое много предполагаемых патогенов пародонта, таких как Р. gingivalis, Porphyromonas endodontalis, Р. intermedia и Parvimonas micro.
Четвертый слой из неприкрепленных клеток состоит в основном из спирохет. Кроме того, Synergistetes spp. формирует столбчатый слой вдоль внешнего края биопленки и находится в непосредственном контакте с иммунными клетками хозяина. Эти бактерии очень трудно вырастить в чистой культуре (большинство из них в настоящее время не поддаются культивированию), но они могут составлять значительную долю поддесневого налета, и их расположение указывает на важную роль в модуляции взаимодействий хозяин-биопленка (Zijnge et al., 2010). Исследование с помощью FISH-метода позволило идентифицировать виды, участвующие в характерных агрегатах, обнаруженных в поддесневых биопленках. Лактобактерии образуют центральную ось некоторых «ершиков» с такими микроорганизмами, как Tannerella, F. nucleatum и Synergistetes spp., радиально расходящимися из этого центра. С помощью FISH-методики наблюдали «початок кукурузы», состоящий из стрептококков, прилипших к дрожжеподобным клеткам или гифам, образующим центральную ось (Zijnge et al., 2010).
Сообщалось также, что «початок» образуется при связывании стрептококков и Corynebacterium matruchotii, а также Veillonella spp. и Eubacterium spp.
Бактериальный метаболизм в бляшке приводит к формированию градиентов ключевых для роста микроорганизмов параметров зубных биопленок (питательные вещества, pH, кислород и т.д.). Эти градиенты не обязательно линейны; использование микроскопии с двухфотонным возбуждением в сочетании с флюоресцентной прижизненной визуализацией продемонстрировало значительный разброс pH на относительно коротких расстояниях в модели смешанной культуры оральных биопленок (Vroom et al., 1999). Такая экологическая гетерогенность позволяет выжить в зубном налете требовательным бактериям, кроме того, в этих условиях смогут сосуществовать микроорганизмы, которые были бы несовместимы друг с другом в более однородной среде. Это объясняет, как организмы с противоречивыми метаболическими и ростовыми потребностями (к примеру, с точки зрения газового состава и потребности в питании) могут сохраняться на одном и том же участке.
б) Микробный состав зубных биопленок. Как обсуждалось ранее, условия в полости рта поддерживают рост характерной микробиоты, которая включает вирусы, микоплазмы, бактерии, археи, грибы и простейшие (Marsh & Martin, 2009). Бактерии — наиболее многочисленная группа, и на начальном этапе они были охарактеризованы с использованием традиционных культуральных подходов. Со временем стало очевидно большое расхождение между числом бактерий, которые могут быть выращены традиционными методами в культуре, и тем, что наблюдалось непосредственно с помощью микроскопии (Choi et al., 1994; Paster et al., 2001). По оценкам, лишь около 50% постоянной микробиоты полости рта в настоящее время может быть выращено в чистой культуре в лаборатории (Wade, 1999, 2002). Это может быть связано с нашим незнанием требований роста некоторых видов, но, вероятно, также отражает нашу неопытность в попытках изолировать в чистой культуре микроорганизмы, которые развивались на протяжении тысячелетий в рамках сообщества с другими видами (Vartoukian et al., 2010а, б).
Наши знания о богатстве и разнообразии постоянной оральной микробиоты были подкреплены недавним применением культуронезависимых, молекулярных подходов (Pozhitkov et al., 2011; Wade, 2011). Накопленные данные многочисленных исследований различных поверхностей и участков методами амплификации, клонирования и секвенирования гена 16S рибосомной рибонуклеиновой кислоты (рРНК) выявили во рту около 900 видов. Большинство участков (слизистая оболочка или бляшки) содержит 20-30 различных доминирующих видов, в то время как число видов во рту у одного индивидуума может варьировать в диапазоне от 34 до 72 (Aas et al., 2005). Тем не менее эти цифры по-прежнему могут быть занижены, и использование более мощной с высокой пропускной способностью секвенирования платформы следующего поколения даст возможность обнаружить изобилие менее многочисленных видов.
На пути реализации находится проект «Оральный микробиом человека», который ставит своей целью выявить и охарактеризовать всех членов постоянной оральной микробиоты, найденной в полости рта в условиях здоровья и болезни (Dewhirst et al., 2010). Данные размещаются публично в доступном виде на основе базы данных Human Oral Microbiome Database, которая также дает информацию для более крупного проекта «Микробиом человека». Эти сведения выходят за рамки данной главы, где описываются свойства членов постоянной оральной микробиоты человека, и читателю рекомендуется обращаться за более подробной информацией к этому изданию или другим специализированным текстам (Marsh & Martin, 2009).
Рисунок 8. Преобладающие группы бактерий, найденные на различных участках поверхности зуба, а также ключевые особенности каждой среды обитания
Биопленки развиваются на слизистой оболочке и поверхности зубов, кроме того, микробный состав биопленки изменяется на отдельных участках зуба (фиссуры, проксимальные поверхности, десневая щель), отражая врожденные различия в их анатомии и биологии (рис. 8) (Aas et al., 2005; Sachdeo et al., 2008; Marsh & Martin, 2009; Papaioannou et al., 2009). Каждый организм выбирает места обитания с теми свойствами, к которым он лучше всего приспособлен и в которых может длительно существовать. Это также означает, что любые изменения в окружающей среде будут напрямую влиять на состав и активность биопленки. Остальная часть этой главы будет сосредоточена на свойствах зубных биопленок.
Нормальная микробиота фиссур относительно немногочисленна, и организмы, присутствующие там, имеют сахаролитический метаболизм (т.е. их энергия получена в результате распада сахара) и представлены либо аэробами, либо факультативными анаэробами. Преобладают стрептококки, многие из которых производят внеклеточные полисахариды, присутствует также несколько видов грамотрицательных или анаэробных микроорганизмов (Theilade et al., 1982). Условия этого местообитания сильно зависят от воздействия слюны.
В противоположность этому, десневая щель имеет более разнообразную микробиоту, включающую многие грамотрицательные анаэробные и протеолитические виды. Это связано с низким окислительно-восстановительным потенциалом на этом участке и выделением другого набора белков и гликопротеинов из GCF (Slots, 1977). Анаэробы, образующие черный пигмент, для жизнедеятельности имеют абсолютную потребность в гемине и могут получить этот кофактор при расщеплении геминсодержащих молекул хозяина, присутствующих в GCF. Молекулярными исследованиями с использованием культурально-независимых подходов установлено, что десневая щель содержит наиболее разнообразные микробные сообщества в здоровой полости рта, причем 40% амплифицированных клонов представляют новые филотипы. На этом участке могут быть обнаружены многие некультивируемые в настоящее время виды (см. рис. 7б, 8).
Микробиота апроксимальных поверхностей по составу занимает промежуточное положение между микробиотами фиссур и десневых щелей, она также включает много анаэробных видов. На этих участках велика доля Actinomyces spp. (Bowden et al., 1975).
Как уже обсуждалось ранее, однажды сложившийся в каком-либо месте состав резидентной микробиоты долгое время остается относительно стабильным, если значительно не меняется среда обитания. Важно отметить, что эта стабильность, называемая микробным гомеостазом, — не следствие метаболической бездеятельности постоянной микробиоты, но отражает весьма динамичное состояние, когда относительные доли отдельных видов удерживаются в равновесии благодаря многочисленным взаимодействиям, как синергетического, так и антагонистического характера (Marsh, 1989). Этот естественный баланс сохраняется, несмотря на постоянную защитную реакцию со стороны организма-хозяина и регулярного воздействия на полость рта различных незначительных экологических стрессов, таких как диеты, изменения в выделении слюны и гигиенические мероприятия в полости рта (см. рис. 1, а).
Тем не менее микробный гомеостаз может нарушаться, если резко меняется один из ключевых параметров, влияющих на жизнедеятельность бактерий. Если эти изменения достаточно устойчивы или регулярны, они приводят к реорганизации состава биопленки, сопровождающейся ростом доли ранее минорных компонентов (см. рис. 1, б). Такие изменения могут быть обусловлены иммунологическими (к примеру, нейтрофильная дисфункция, ослабление иммунной системы и т.д.) или неиммунологическими факторами (к примеру, сухость во рту, изменение диеты и т.д.), а также создавать условия для развития заболевания (Marsh & Martin, 2009; Marsh et al., 2011b). Эти процессы лежат в основе «экологической гипотезы налета» (Marsh, 2003), которая описывает динамические взаимосвязи между оральной микробиотой и хозяином в состоянии здоровья и болезни.
