а) Первые микроскопические и культуральные микробиологические исследования. Прогресс, достигнутый в описании этиологических возбудителей инфекционных заболеваний в конце XIX и начале XX вв., естественно, привел к поиску организмов, участвующих в инфицировании пародонта. Эти исследования были ограничены несовершенством методик, позволяющих проводить визуальный осмотр поддесневых образцов и относительно примитивными культуральными методами, которые были разработаны на этой стадии развития микробиологии. Socransky и Haffajee (1994) обобщили результаты этих ранних исследований в описании четырех групп потенциальных этиологических агентов.

Во-первых, на основе культуральных микробиологических исследований было выдвинуто предположение о том, что важную роль в развитии болезни играют стрептококки. Это был, видимо, неизбежный вывод, поскольку культуральные методы этого периода были несовершенны с точки зрения разнообразия обнаруживаемых организмов, и стрептококки были, скорее всего, единственной группой, которая хорошо культивировалась. Как показатель относительно примитивного состояния бактериальной систематики в то время, стоит отметить, что в начале XX в. продолжались дебаты о том, относятся ли все стрептококки к одному бактериальному виду.

Только с развитием более точных методов определения стала очевидной гетерогенность стрептококков, которая сейчас служит отличительной чертой этого рода. К примеру, Gordon (1905) заявил, что «методы разделения видов, рекомендованные мной в предыдущих докладах и применяемые в последние годы для тщательного изучения стрептококков в молоке, слюне, воде, экскрементах, а также в зараженных и других материалах, дают, по моему мнению, определенную основу (до сих пор отсутствовавшую), на которой строится классификация стрептококков. Вкратце, представление о единстве стрептококков возникло, главным образом, из-за непригодности старых лабораторных методов для разделения видов».

Остальные три группы организмов, которые считались потенциальными возбудителями заболеваний пародонта, были описаны на основе микроскопии. Окрашенные мазки зубного налета показали наличие амеб, сообщалось также, что их было больше в пробах, отобранных из пораженных участков пародонта, по сравнению со здоровыми или при гингивите. Препарирование влажных препаратов или специфические методы окрашивания позволили визуализировать спирохеты, при этом было высказано предположение о том, что количество этих бактерий положительно связано с болезнями пародонта. Наконец, фузобактерии, которые легко обнаружить с помощью световой микроскопии из-за их характерных крупных клеток веретеновидной формы, также были определены как возбудители болезни, в частности при остром некротическом язвенном гингивите (НЯГ), который, видимо, был относительно распространенным заболеванием в первой половине XX в.

Особенно часто данная патология встречалась в войсках во время Первой мировой войны и называлась «окопной рот».

Для каждого из этих агентов, однако, дальнейшие исследования — на основе сопоставимых исследований в других группах пациентов или использования схем лечения, разработанных специально для этих организмов, — оказались не в состоянии доказать, что именно эти организмы составляют микробиологическую основу заболевания. Это, возможно, отражает тот факт, что микробная этиология заболеваний пародонта различна у разных пациентов, она многофакторна даже у одного человека. Кроме того, эти ранние исследования были сильно зависимы от аналитических инструментов, доступных в то время. Вероятно, в результате неспособности точно определить этиологический агент(ы) заболевания, в отличие от успешного описания болезнетворных микроорганизмов в других областях при моноспецифичных инфекционных болезнях, в первые десятилетия XX в отмечалось снижение интереса к микробиологическим исследованиям болезней пародонта.

Тем не менее для врачей, занимающихся лечением пародонта, было очевидным, что контроль зубного налета имеет исключительное значение как для лечения, так и для профилактики заболевания. Как следствие, на первый план вышло понятие «неспецифическая этиология». Гипотеза о «неспецифическом» налете предполагает, что скопления микроорганизмов на уровне десневого края или ниже выделяют раздражающие вещества, приводящие к воспалению, которое, в свою очередь, вызывает разрушение тканей пародонта. В этом случае, хотя бактериям отводилась важная роль в этиологии заболевания, решающими факторами были общее количество бактерий и их воздействие на местные ткани человека, а не присутствие определенных видов бактерий. Альтернативные гипотезы, которые описывают более конкретную этиологию, будут представлены в отдельной статье на сайте.

б) Появление анаэробных микробиологических методов. Крупный прорыв в нашем понимании сложности микробиоты пародонта был достигнут за счет внедрения методов, которые позволили культивировать анаэробные микроорганизмы. Низкое содержание кислорода в поддесневой биопленке — благоприятные условия для роста облигатно анаэробных бактерий, и, следовательно, значительная часть общей микробиоты пародонта осталась незамеченной при предыдущих микробиологических исследованиях, проведенных в аэробных условиях. Технологический прогресс позволил использовать анаэробные рулонные трубы и анаэростат, которые могут быть промыты бескислородными газами, а затем запечатаны для предотвращения доступа воздуха.

Недавно были разработаны анаэробные камеры, которые позволяют культивировать анаэробные бактерии как на твердых, так и в жидких средах в низкокислородных условиях с периодическим продуванием смесью азота, диоксида углерода и водорода.

Эти исследования были начаты несколькими лабораториями оральной микробиологии в 1970-80-х годах (Socransky et al., 1963; Socransky, 1970; Slots, 1976, 1977; Tanner et al., 1979; Slots & Rosling, 1983; Haffajee et al., 1984; Christersson et al., 1985; Dzink et al., 1985; Loesche et al., 1985; Dzink et al., 1988; Haffajee et al., 1988; van Winkelhoff et al., 1988; Zambon et al., 1988; Tanner & Bouldin, 1989; Zambon et al., 1990; Slots et al., 1991; Socransky & Haffajee, 1994). Весьма трудоемкие методы означают, что эти исследования, как правило, ограничиваются анализом относительно небольшого числа микроорганизмов, населяющих пародонт. Важно, однако, что эти исследования очень четко выясняли существенные качественные различия в общей микробиоте, присутствующей на пораженных участках пародонта, по сравнению с контрольными здоровыми участками и определили некоторые ключевые, специфические организмы, которые часто связаны с болезнью.

Исчерпывающие данные, полученные в лабораториях Holdeman и Moore Политехнического института Вирджинии (Moore et al., 1983, 1985; Moore, 1987), типичны для таких исследований и стали одними из наиболее значимых для определения общей, культивируемой, анаэробной микробиоты. Авторы использовали для исследования микробного сообщества пародонта методы, разработанные для исследований анаэробной микробиоты кишечника. В ряде публикаций 1980-х годов, в частности, эти авторы описали бактериологию хронической и тяжелой болезни пародонта у взрослых, экспериментального гингивита и ювенильного пародонтита у подростков, а также показали долговременную стабильность микробиоты пародонта. Как правило, эти исследования включали отбор проб поддесневой микробиоты на одном или нескольких пораженных участках и на соседних наддесневых контрольных участках, а затем культивирование на селективных и неселективных средах в анаэробных рулонных трубах или анаэростатах, а затем в анаэробных камерах.

Были выделены отдельные колонии, и затем на основе различных морфологических, серологических и биохимических методов установлена идентичность полученного чистого изолята. Единичное исследование часто включало выделение и характеристику буквально тысяч изолятов для построения полной картины общей культивируемой микробиоты. Это были незаурядные исследования, использовавшие трудоемкие и времязатратные методики. К примеру, в бактериологическом исследовании тяжелого генерализованного пародонтита у 21 пациента авторы, используя биохимические методики, описали выделение и дали характеристику 2723 изолятам, включавшим 190 видов бактерий, подвидов или серотипов (Moore et al., 1982). Из выделенных видов И составляли более чем по 1% поддесневой микрофлоры и были наиболее тесно связаны с пораженными десневыми бороздами, 11 других также выделялись достаточно часто, что позволило предположить их участие в разрушении тканей.

Примеры результатов этих исследований можно увидеть в табл. 1, где показаны типы культивируемых бактерий, наиболее многочисленные в поддесневых областях у молодых взрослых с выраженной стадией заболевания пародонта по сравнению с образцами наддесневого налета, и, наоборот, те, которые были более многочисленны в наддесневом образце. Это исследование подчеркивает заметное различие между общей микробиотой в поддесневых участках пораженного пародонта и микробиотой соседнего наддесневого участка. В то время как в наддесневой микробиоте доминируют актиномицеты, стрептококки и вейлонеллы, которые составляют около 40% общего количества культивируемых бактерий, эти роды представляют собой лишь около 10% поддесневых организмов. С другой стороны, бактероиды и фузобактерии составляют 20% поддесневой микробиоты, но только 5% наддесневой.

Исследования такого рода на невиданном прежде уровне убедительно показали огромную сложность микробиоты пораженного пародонта. Был создан и стал развиваться информационный каталог бактериальных таксонов, бесценный для дальнейших исследований. Кроме того, были сделаны некоторые важные дополнительные сообщения. Во-первых, как это видно из табл. 1, зачастую бактерии, представляющие важные компоненты поддесневого налета на пораженных участках, также присутствуют, хотя и в меньших количествах, в наддесневых образцах, и наоборот. Действительно, другие исследования показали, что многие из бактерий, связанных с микробиотой пораженного поддесневого участка, также присутствовали на здоровых поддесневых участках.

Эти исследования показали, что специфическая этиология заболеваний пародонта может быть объяснена скорее в количественном, нежели в качественном аспекте. Для того чтобы получить достаточно оснований для выявления характера этиологии, было бы необходимо провести исследования с участием значительно большего числа образцов/субъектов, чем это было возможно при общем подходе к микробиологическому анализу, который обычно ограничивался обследованиями относительно небольшого числа пациентов. Тем не менее эти широкомасштабные анаэробные микробиологические анализы относительно небольшого числа образцов выявили несколько ценных, потенциальных «конкретных патогенов пародонта» для будущих исследований, в которых возможно увеличить размер выборки за счет более целенаправленного аналитического подхода (табл. 2).

Кроме того, из данных табл. 1 также очевидно, что таксономическая классификация многих из этих недавно описанных бактериальных таксонов недостаточно разработана, и не в последнюю очередь в случае Bacteroides. Именно поэтому приоритетной задачей было уточнение систематики микробиоты пародонта.

Значительные усилия были приложены к систематическому анализу ряда выявленных организмов с помощью биохимических, физиологических и иммунологических подходов. В результате, постепенно стало очевидным разнообразие некоторых организмов, ранее отнесенных к одному бактериальному виду (рис. 3). Эта реклассификация была существенно ускорена за счет применения анализа молекулярной ДНК этих бактерий, в частности, путем сравнительного анализа гена 16S рРНК, что способствовало разделению отдельных видов. Этот процесс играет существенную роль в определении тех видов бактерий, которые наиболее тесно связаны с процессом заболеваний пародонта. В данном случае речь идет о пересмотре таксономии выделяющих черный пигмент бактероидов и таксономических изменениях в классификации Bacteroides melaninogenica, как показано на рис. 4.

За счет успешного применения более точных схем идентификации стало понятно, что считавшееся ранее единым целым содержит два различных рода (Porphyromonas и Prevotella) и несколько видов в пределах каждого из этих родов. Важно отметить, что, в то время как актуальность образующих черный пигмент организмов в инфицировании пародонта была очевидна при культуральных исследованиях в течение нескольких десятилетий, таксономическое определение этой группы организмов позволило определить, какие виды наиболее тесно связаны с болезнью. Таким образом, становится очевидным, что, хотя Porphyromonas gingivalis критически важна для развития пародонтита и в настоящее время классифицируется как одна из бактерий красного комплекса, эта же группа организмов также содержит виды, которые часто сопутствуют здоровому пародонту.

- Также рекомендуем "Культуральные и иммунохимические исследования микрофлоры полости рта"

Редактор: Искандер Милевски. Дата публикации: 25.11.2022