Методы идентификации бактерий полости рта, основанные на определении нуклеиновых кислот
По мере пополнения каталога основных культивируемых видов микробиоты пародонта на основе культурального микробиологического анализа возникла необходимость в менее трудоемких и затратных по времени методах для проведения более широких эпидемиологических исследований связи этих микроорганизмов со здоровьем и болезнью. Это было достигнуто за счет внедрения методов, которые не требовали культивирования материала сразу после взятия пробы.
Наиболее часто использовали исследования нуклеиновых кислот — ПЦР-амплификации специфических областей хромосомы изучаемого организма, обычно гена 16S рРНК, с последующим количественным определением продукта и методов гибридизации ДНК-ДНК.
а) ДНК-ДНК гибридизация методом «шахматной доски». Скачок вперед в наращивании пропускной способности микробиологических анализов зубного налета на различных участках пародонта произошел с введением и применением технологии ДНК-ДНК гибридизации. Методика «шахматной доски» позволяет одновременную гибридизацию 45 образцов ДНК, выделенных из пародонтального налета, с 30 различными ДНК-зондами на одной мембране.
Рисунок 5. Анализ ДНК-ДНК методом «шахматной доски». Вертикальные полосы — образцы налета, пронумерованные 11-47, и две крайние правые вертикальные полосы — стандарты, содержащие либо 105, либо 106 клеток каждого испытуемого бактериального вида. Горизонтальные полосы содержат геномные ДНК-зонды, помеченные дигоксигенином, для каждой представленной бактерии.
Сигнал на пересечении вертикальной и горизонтальной полос указывает на наличие бактериального вида, а интенсивность сигнала связана с количеством присутствующих бактериальных клеток. Методология позволяет одновременно и быстро проанализировать 40 различных видов бактерий в 28 различных образцах налета.
Зонды ДНК могут или быть получены из всей геномной ДНК, выделенной из соответствующей целевой бактерии или альтернативно от ПЦР-ампликонов бактериальных видоспецифичных областей рРНК гена 16S. Гибридизацию образца ДНК с ДНК-зондом затем визуализируют с помощью хемофлюоресцентного сигнала, интенсивность которого пропорциональна количеству ДНК исследуемого организма в каждом образце (рис. 5).
Хотя есть некоторые ограничения в точности идентификации отдельных видов бактерий из-за возможной перекрестной гибридизации ДНК близкородственных видов бактерий в одном образце, эта технология произвела революцию в анализе клинических образцов и возможности выявить связи определенных сообществ бактерий со здоровьем и болезнью пародонта. Теперь можно выполнить качественный и количественный анализ бактериального состава гораздо большего числа клинических образцов, чем при использовании прежних культуральных методик. К примеру, в знаменательном исследовании Socransky et al. (1998) проанализировано около 13 000 образцов зубного налета от 185 субъектов с использованием целых геномных ДНК-зондов 40 видов бактерий.
Ассоциации видов выявляли с помощью методов кластерного анализа и ординации сообществ. Одним из ключевых и фундаментальных открытий этого исследования, отразившемся на понимании природы инфекций пародонта, было определение, что со здоровьем или с болезнью пародонта связано присутствие определенных бактериальных сообществ, а не отдельных видов бактерий (рис. 6).
Рисунок 6. а — Ассоциации поддесневых видов. Разные цвета в пирамиде представляют собой различные бактериальные комплексы, которые часто обнаруживаются в сочетании друг с другом. Основание пирамиды представляет собой раннюю стадию развития налета, в то время как вершина содержит последние виды в установившейся микробиоте. Красный комплекс бактерий включает микроорганизмы, часто связанные с участками пораженного периодонта. (Источник: Socransky & Haffajee, 2002. Воспроизводится с разрешения John Wiley & Sons).
б — Круговые диаграммы средних процентных значений положительных ДНК-зондов микроорганизмов разных групп в наддесневом налете. Образцы зубного налета у пациентов со здоровым пародонтом (58) и с пародонтитом (136), а также образцы поддесневого налета у пациентов со здоровым пародонтом (189) и с пародонтитом (635). Эти виды были сгруппированы в семь групп микроорганизмов в соответствии с описанием Socransky et al. (1998) и более подробно представлены на рис. а.
Категория «другие» представляет зонды для видов, которые попадают в комплекс, а также зонды к новым видам, чьи отношения с другими видами до сих пор не установлены. Площади круговых диаграмм были скорректированы по средним значениям от общего количества ДНК-зондов на каждом из участков образца. Значимость различий средних значений в процентном отношении над- и поддесневых комплексов в здоровом и пораженном пародонте тестировали с использованием теста Крускала Уоллиса. Все комплексы значительно отличались в разных группах (р<0,001 после корректировки в семи сравнениях).
Это открытие привело к концепции, что возможна зависимость бактерий друг от друга, или синергизм между различными видами бактерий, действующих совместно как особый комплекс. Комплекс видов, наиболее тесно связанный с заболеванием пародонта, подвергся пристальным интенсивным исследованиям. «Красный комплекс» состоит из трех видов бактерий: Р. gingivalis, Treponema denticola и Tannerella forsythia. Другие комплексы, например желтый, включающий в себя, главным образом, различные виды Streptococcus, или «зеленый», в котором преобладают виды Capnocytophaga, представляют собой ранних колонизаторов зубного налета, которые более тесно связаны со здоровым пародонтом.
«Оранжевый комплекс» содержит те организмы, которые, как правило, колонизируют зубной налет позже: Fusobacteria, Prevotella и виды Campylobacter. Присутствие этих организмов по современным представлениям облегчает колонизацию зрелого зубного налета организмами «красного комплекса» либо путем представления соответствующих участков прикрепления, либо путем создания благоприятных условий для роста этих более прихотливых видов.
Следует отметить, что A. actinomycetemcomitans — бактерия, связанная с AgP у выходцев из Западной Африки, не входит в одну группу с наиболее болезнетворными организмами «красного комплекса». Возможно, это отражает очень большое влияние генетического фона хозяина на заболевание, связанное с этой бактерией, как было описано выше.
Использование технологии «шахматной доски» позволяет решить ряд вопросов, касающихся, к примеру, последовательных изменений, которые происходят в составе наддесневого и поддесневого налета в процессе его развития, а также качественного и количественного влияния чистки зубов на микробиологию наддесневого и поддесневого налета. На рис. 6, б представлен пример такого рода исследования, показавшего связанные с болезнью существенные качественные и количественные изменения не только в поддесневом, но и наддесневом налете.
Рисунок 7. Графики средней численности (х105) для 40 таксонов бактерий в образцах поддесневого налета в начале исследования и через 12 мес после лечения участков, где измеряемый уровень прикрепления (AL) повышался >2 мм (левая панель), изменялся 22 мм (средняя панель) или снижался >2 мм (правая панель).
При подсчете каждого вида на участках на каждом из трех уровней прикрепления были определены категории изменений, средние для одного пациента, а затем усреднены по пациентам по трем категориям участков по отдельности на момент начала исследования и через 12 мес после лечения.
Достоверность различий между подсчетами на исходном уровне и через 12 мес определяли с помощью теста Уилкоксона и адаптировали для множественных сравнений. (*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001). Виды были упорядочены в соответствии с микробными комплексами.
Кроме того, чувствительность анализа методом «шахматной доски» означает, что можно было выявить микробиологические различия между участками периодонта как у одного пациента, так и между разными людьми и соотнести эти различия со случаями заболевания пародонта. К примеру, рис. 7 демонстрирует изменения 40 видов бактерий до и после 12 мес лечения в участках, где произошло улучшение прикрепления >2 мм в участках, где произошла потеря прикрепления >2 мм, а также участках, где изменение в уровне прикрепления было промежуточным между этими двумя крайними значениями. Эти данные дают прекрасное представление о широкомасштабных изменениях в составе микробиоты, которые происходят в пародонте на участках с различным течением заболевания.
Так, наблюдается значительное снижение количества представителей «красного комплекса» микроорганизмов в тех местах, где отмечается повышение уровня прикрепления, точно так же очевидно, что значительные изменения происходят и в численности многих других видов. Таким образом, даже этот обзор 40 микроорганизмов показывает, что общая структура популяции бактерий на участке пародонта может сильно повлиять на исход заболевания.
б) ПЦР-амплификация гена 16S рРНК бактерий пародонта. 16S рРНК — компонент 30S малой субъединицы всех бактериальных рибосом. Гены, кодирующие ее, носят название 16S рДНК. Хотя последовательности 16S рДНК высоко консервативны у различных бактерий, она также содержит гипервариабельные области, которые могут обеспечить видоспецифичные сигнатурные последовательности, пригодные для идентификации бактерий. Так что, как только последовательность гена 16S рДНК бактерии определена, можно разработать ПЦР с использованием праймеров, которые будут ренатурировать последовательности в пределах гипервариабельных областей для специфической амплификации только рДНК 16S из целевой бактерии.
Большие преимущества применения данной методики в выявлении бактерий пародонта в клинических образцах заключаются в высокой чувствительности обнаружения, большой пропускной способности, скорости анализа, а также многочисленности видов бактерий, которые могут быть обнаружены в одной реакции — мультиплексной ПЦР. В результате эта технология широко используется для обнаружения предполагаемых пародонтальных патогенов. Как правило, эти исследования были сосредоточены на выявлении лишь нескольких видов бактерий, в том числе точно установленных бактерий пародонта Р. gingivalis, Т. forsythia, Т. denticola и A. actinomycetemcomitans (Leys et al., 2002; de Lillo et al., 2004; Sanz et al., 2004; Tanner et al., 2006).
Тем не менее исследования, включающие ПЦР-амплификации гена 16S рДНК, также использовались, чтобы подтвердить наличие новых видов бактерий, присутствие которых первоначально было обнаружено путем клонирования и анализа последовательности гена 16S рДНК в пародонтальных образцах. Эти исследования подтвердили, что несколько дополнительных видов, в том числе и те, которые еще не были культивированы в лабораторных условиях, связаны с гигиеной полости рта или пародонта.
Первые исследования в этой области были в основном качественного характера, они лишь определяли, присутствовал или отсутствовал микроорганизм (или, более правильно, его численность была ниже пределов обнаружения — как правило, 100 бактериальных клеток). Совсем недавно была внедрена ПЦР в режиме реального времени, также упоминаемая как количественная ПЦРq, или ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции qRT-PC: она дает возможность квантифицировать количество копий интересующего гена в данном образце.
ПЦР в режиме реального времени использовали для выявления и количественной оценки нескольких патогенных микроорганизмов пародонта, в том числе A. actinomycetemcomitans, Р. gingivalis и Prevotella intermedia, и общего количества бактерий в клинических образцах (Lyons et al., 2000; Maeda et al., 2003; Boutaga et al., 2007; Atieh, 2008).
