Трансгенные мыши - кратко с точки зрения эмбриологии
Основа. Молекулярная биология. Изолированные гены могут быть клонированы и усилены в бактериях или усилены посредством теплоустойчивой бактериальной полимеразы ДНК, используя «цепную реакцию полимеразы» (PCR). Функция изолированного структурного гена может быть тестирована в пробирке.
ДНК может быть введена в клетки культуры ткани с помощью микроманипулятора. Клетки интегрируют одну или более копий гена в своем геноме, дублируют ее в клеточном цикле и выделяют генный продукт, который находится под последовательным контролем промоутера и оператора, объединенных в гене. Функция регулирующих генов, которые управляют детерминацией клеток и тканей в течение эмбрионального развития, может быть тестирована только на целом организме.
С этой целью используются трансгенные мыши. Пример — демонстрация функции «определяющей пол области» (SRY), которая была изолирована из Y-хромосом мыши и человеческих клеток.
А. Получение трансгенных мышей. Б. Идентификация определяющей пол области (SRY) в Y-хромосоме
А. Получение трансгенных мышей:
1. Инъекция ДНК. Оплодотворенные ооциты взятые из маточного рога мыши-донора, путем смыва 10-10 мл (0,1 пл) раствора ДНК (содержащего интересующий ген), вводятся в мужской или женский пронуклеус с помощью микроманипулятора .
2. Перемещение бластоцисты. После завершения процесса дробления в пробирке бластоцисты помещаются в матку псевдобеременной мыши, где они заканчивают свое развитие.
3. Трансгенные мыши. Приблизительно от 10 до 30% новорожденных мышат воспроизводят введенную ДНК во всех тканях тела, включая половые клетки. Так как ДНК была введена только в один из пронуклеусов, животные с перемещенным геном — гетерозиготные.
4. Образование наследственных (врожденных) черт. Трансгенные особи спариваются с нормальными мышами. Половина потомства — снова гетерозиготные особи с введенным геном. Путем обратного скрещивания с трансгенным родителем может быть выведена гомозиготная порода мыши с перемещенным геном.
Б. Идентификация определяющей пол области (SRY):
1. Цитогенетическая локализация. Половые хромосомы были открыты в 1959 г. У млекопитающих хромосома Y вызывает развитие яичка и, таким образом, инициирует развитие особей мужского пола. В других случаях формируется постоянно женский фенотип. В 1966 г. цитогенетический анализ половых хромосомных аберраций у человека показал, что определяющая мужской пол область находится в короткой ножке хромосомы Y (Yp).
Так как единственный известный до этого генный продукт хромосомы Y был антиген тканевой совместимости HY, то этот белок долго считали кандидатом на определяющий развитие яичка фактор. Анализ мужских XX особей и мышей с измененным полом (SXR) привел к выделению области соединения между X- и Y-хромосомами, с помощью которой последовательность, определяющая развитие яичка, могла быть передана хромосоме X.
В 1986 г. эта область была выделена у мужских XX пациентов 140 кб (килобаз, килобаза или пара основ — единица измерения длины цепочек нуклеиновых кислот, принятая в западной науке. 1 килобаза = 1000 нуклеотидов. — Примеч. перев.). Эта последовательность ДНК содержит регуляторный ген, кодирующий "zinc-flnger"-белок. Путем анализа мужских XX пациентов с отсутствующей областью определения пола рассматриваемая область была уменьшена до 60 кб.
Анализ дополнительной группы пациентов и пропуск повторных генных последовательностей уменьшили определяющую пол область Y-хромосомы до 35 кб (SRY, человеческая последовательность, выраженная в заглавных буквах).
2. Трансфекция SRY-последовательности в породу мыши. Путем трансфекции 35 кб последовательности генов мыши в инбредную породу Koopman и его сотрудникам (1991) удалось получить двух трансгенных XX самцов. Регуляторный ген SRY (2а), который вводится в зиготу, активируется в клетках Сертоли гонад в XX эмбрионах (2б).
Он вызывает развитие яичка и, таким образом, формирование мужского фенотипа (2в). Ген SRY обладает ударной центральной HMG-группой («группа высокой подвижности»), которая связывается с ДНК без специфической последовательности.
