Иммунотерапия подразумевает использование антител и их фрагментов в лечебных целях. Антитела представляют собой сложные гликопротеины, синтезируемые В-лимфоцитами и плазматическими клетками; они являются производными иммуноглобулинов G (IgG), М (IgM) и A (IgA). Главный иммуноглобулин в кровотоке — IgG; его же обычно применяют и в терапевтической практике.
Каждая молекула иммуноглобулина состоит из двух класс-специфичных тяжелых и двух легких цепей, соединенных таким образом, что образуется 2 участка связывания. IgG можно расщепить ферментом пепсином, получив антигенсвязывающий фрагмент F(ab)2 с двумя участками связывания и кристаллизующийся фрагмент Fc с молекулярной массой около 60 000, не участвующий в связывании антигена.
IgG можно также расщепить папаином, получив 2 идентичных фрагмента Fab с молекулярной массой у каждого примерно 50 000 и единственным участком связывания, а также константный фрагмент Fc, аминокислотная последовательность которого определяет основную функциональную активность молекулы.
а) История иммунотерапии. Антитела, полученные от лошадей, часто вызывали тяжелые, а иногда и летальные побочные эффекты. Этот риск иммунотерапии понизился с переходом на овечьи антитела и применение Fab вместо интактных IgG или F(ab)2. Потенциал иммунотерапии увеличился также благодаря получению антител против мелких молекул (гаптенов), например лекарственных средств в результате связывания гаптенов с белком-носителем.
б) Поликлональные и моноклональные антитела. Антитела, вырабатываемые животными, называются поликлональными, поскольку их дают многочисленные клоны В-лимфоцитов. Каждый из них синтезирует иммуноглобулины на "свой" участок (эпитоп) антигена, причем связываются они с ним с разной силой (аффинностью).
Большинство фирм и исследовательских групп производят моноклональные антитела, используя гибридомы, состоящие из В-лимфоцитов, слитых с опухолевыми клетками. Эти антитела связываются только с одним эпитопом и с одинаковой аффинностью, но бывают менее эффективными, чем их поликлональные аналоги.
в) Производство поликлональных антител. Поликлональные Fab против дигитоксина, трициклических антидепрессантов и некоторых змеиных ядов производятся следующим образом.
1. Выделяют или синтезируют соответствующий иммуноген.
2. Готовят водно-масляную эмульсию этого иммуногена в адъюванте Фрейнда.
3. Иммунизируют овцу 1 раз в месяц в 6 местах.
4. Регулярно берут у нее пробы крови и при достижении в ней требуемого титра (уровня) антител каждый месяц получают от овцы кровь (10 мл/кг массы тела).
5. Отделяют эритроциты от антисыворотки (сыворотки, содержащей антитела).
6. Осаждают фракцию иммуноглобулинов антисыворотки сульфатом натрия.
7. Расщепляют антитела папаином, получая специфичные и неспецифичные Fab.
8. Очищают специфичные Fab методом аффинной хроматографии.
г) Токсикокинетические критерии:
• Знание структуры активного токсина. Некоторые соединения действуют главным образом посредством своих метаболитов; нужны антитела, перекрестно реагирующие с этими активными метаболитами. У препаратов наперстянки реактивны как содержащийся в исходном лекарственном средстве дигоксин, так и его метаболиты. Сходный подход используется при отборе антител к трициклическим антидепрессантам.
• Знание молекулярного механизма действия токсина. Антитела к параквату неэффективно уменьшают его содержание в клетках легких из-за сильного связывания там этого вещества.
• Адекватные фармакокинетические параметры токсина. Если у токсина небольшой кажущийся объем распределения и высокий общий клиренс, иммунотерапия не рекомендуется. Достаточно классических методов выведения вещества из организма. Иммунотерапия наиболее эффективна в отношении токсинов с низким клиренсом и большим объемом распределения.
• Знание кривой зависимости "доза — летальность". Эта кривая нужна для оценки количества антигенсвязывающих центров (АСЦ) антител, необходимого для устранения с их помощью риска для жизни. Если кривая крутая, достаточно небольшого количества АСЦ (сердечные гликозиды, колхицин). Если вещество токсично только в высоких дозах (трицикличе-ские антидепрессанты, хлорохин), необходимо много АСЦ.
В иммунотерапии обычно используют Fab-фрагменты, поскольку они лучше диффундируют в компартментах тела и обеспечивают более высокий почечный клиренс конъюгатов токсин-АСЦ, чем IgG и (Fab)2.
Действие mAb на клетку опухоли.
1 — антитело mAb связывается с антигеном опухолевой клетки и вызывает или ее комплемент-зависимую гибель, или гибель в результате антителозависимой атаки макрофагами.
2 — с mAb связан радиоактивный изотоп, токсин или цитокин, вызывающие гибель клетки. Также с антителами может быть связан фермент, участвующий в превращении препарата в активную форму.
3 — биспецифические mAb. Один сайт связывается с опухолевой клеткой, другой — с киллерной эффекторной клеткой.
4 — антитела mAb связаны с липосомами, которые содержат химотерапевтические препараты или токсины.
- Трициклические антидепрессанты. Токсичные дозы трициклических антидепрессантов (ТЦА) выше, чем удигоксина и колхицина. Следовательно, купирование токсичности первых может потребовать большого количества Fab. Сейчас разрабатываются антитела, распознающие главным образом трициклическое ядро, т. е. как саму молекулу ТЦА, так и ее активный деметилированный метаболит.
Исследования анти-ТЦА-препаратов на животных, похоже, говорят о нейтрализации действия ТЦА в сосудистом компартменте с уменьшением их распределения в сердце. Вероятно, это представляет интерес с точки зрения лечения острого отравления человека этими веществами.
При отравлении ТЦА (амитриптилином) в альфа-фазе периода полужизни, т. е. через 1,5—31 ч после перорального приема, возможны эпилептические припадки. Вероятно, объем распределения в этой фазе более значимо, чем другие параметры, коррелирует с симптомами острого отравления ТЦА. Он невелик, поэтому для понижения плазменных концентраций ТЦА необходимо относительно мало антидота.
При добавке бикарбоната натрия к анти-ТЦА-Fab индуцированное дезипрамином удлинение комплекса QRS у крыс, похоже, снижается сильнее, чем при использовании каждого из этих веществ по отдельности. В этой области необходимы дальнейшие исследования на животных и клинические испытания, запланированные уже на ближайшие годы.
- Колхицин. Колхицин, связываясь с тубулином, блокирует митоз в метафазе. Это связывание обратимо. Период полужизни комплекса тубулин—колхицин составляет около 36 ч. Колхицин токсичен на уровне многих органов. Тяжесть состояния и смертность четко зависят от дозы. После перорального приема от 0,5 до 0,8 мг/кг смертность колеблется в пределах 10—50 %, а если доза выше, достигает 100 %.
Летальная интоксикация отмечалась у взрослых, принявших 7—12 мг или получивших внутривенно 6 мг колхицина. В настоящее время лечение основано на очистке пищеварительного тракта путем раннего промывания желудка и интенсивной поддерживающей терапии, направленной на купирование шока, а также гематологических и коагуляционных расстройств, предупреждение сепсиса и коррекцию электролитного баланса.
Полезны бывают плазмозаменители (при шоке) и инотропные средства. Однако даже при интенсивной терапии смертность остается высокой. Антитела к колхицину, вероятно, способны удалить его из органов-мишеней еще до поражения их клеток. Эти антитела в любом случае показаны пациентам, принявшим дозу более 0,8 мг/кг, которая, скорее всего, смертельна.
Традиционная терапия малоэффективна из-за большого объема распределения колхицина и его низкой концентрации в кровотоке. У этого вещества низкий системный клиренс. Fab, полученные от коз, при введении мышам и кроликам улучшают выживаемость последних после отравления, повышают плазменную концентрацию колхицина в 10—16 раз, увеличивают площадь под кривой "плазменная концентрация — время", уменьшают свободную фракцию колхицина в плазме, в 24 раза снижают объем его распределения и увеличивают выводимое с мочой количество.
Козьи IgG-антитела к колхицину, введенные мышам, по-видимому, ослабляют токсический эффект и снижают смертность. Исследования на животных определили также особенности связывания колхицина с тубулином и антителами. Соответствующих данных по человеку пока нет. Это вещество быстро всасывается в пищеварительном тракте. Клинические испытания могли бы подтвердить пользу введения Fab в первые часы отравления. Для проведения таких испытаний надо получить на них разрешение соответствующих организаций, в частности Управления США по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA).
- Олеандр. Предварительные исследования лечения антидигоксиновыми Fab отравившихся олеандром собак наводят на мысль, что высокие дозы Fab могут устранять аритмию и гиперкалиемию. Для подтверждения этого вывода и оценки действия более низких доз Fab необходимы дальнейшие опыты.
- Паракват. Полученные от кроликов антитела к параквату вводили крысам перед внутривенной инъекцией им параквата в дозе 0,1 мг/кг. Плазменная концентрация токсина возросла, а его количество в моче снизилось. Таким образом, иммунотерапия приводит к секвестрированию параквата в плазменном компартменте, но не препятствует его накоплению в тканях. Исследования по этой проблеме продолжаются.
- Фенциклидин (РСР). Специфических антагонистов действия РСР нет. Это вещество липофильно, широко распределяется по внесосудистому компартменту и обладает низким почечным клиренсом. Такие токсикокинетические особенности говорят в пользу применения иммунотерапии. Высокоаффинные специфичные к РСР Fab-фрагменты теоретически должны привести к его перераспределению и инактивации в результате прочного связывания.
Исследования на животных высокоаффинных козьих антител продемонстрировали немедленное повышение сывороточной концентрации РСР в 11—56 раз, что говорит о необратимом удалении существенных количеств этого вещества из периферического компартмента. Наблюдалось также уменьшение объема распределения (VD) в 10 раз. Fab, по-видимому, не влияют на период полувыведения РСР (t1/2). Поскольку t1/2 = 0693VD/CLs (CLs — системный клиренс), а изменения VD и CLs одного порядка (примерно в 10 раз), это вполне естественно. Доля несвязанного РСР снижается примерно с 50 % перед применением Fab до менее 1 % после их введения.
Эффективны ли они в смысле устранения клинической картины интоксикации, еще предстоит выяснить.
- Мышьяк. Низкая молекулярная масса, большой объем распределения, антигенность и сильное действие соединений мышьяка делают их удобной моделью для изучения терапевтического применения антител. Овальбумин-азобензоларсенат индуцирует образование антител у мыши. Предварительные исследования говорят о слабом их влиянии на смертность этих животных от отравления мышьяком. Для ее заметного снижения, вероятно, потребуется дополнительная очистка антител. Определение эффективности иммунотерапии при таких отравлениях нуждается в дальнейшем изучении.
