Выявление большего и существенного микробного разнообразия за счет идентификации множества малочисленных видов и организмов, не способных развиваться в обычной лабораторной культуре, привело к разработке новой диагностической методики, позволяющей быстро определять множество бактериальных филотипов в пораженном пародонте (Paster & Dewhirst 2009).
Микроматричный анализ микроорганизмов полости рта человека (МАМПРЧ) был разработан, чтобы исследовать сложное микробное сообщество полости рта при одиночной гибридизации на предметных стеклах (Paster et al., 2006; Preza et al., 2008, 2009b). Высокая пропускная способность и технология специфичных 16S рРНК обеспечивает одновременное обнаружение порядка 300 основных и преобладающих видов бактерий, в том числе видов, которые не поддаются культивированию.
16S рРНК-специфичные олигонуклеотидные зонды нанесены на предметные стекла. Гены рРНК 16S в клинических образцах подвергают ПЦР-амплификации с использованием 16S рРНК универсального прямого и обратного флуоресцентно-меченых праймеров, а затем гибридизируют с зондами на стеклах. Для анализа больших массивов данных из МАМПРЧ-массивов отдельные сигналы преобразуют в формат «штрих-кода», в котором полосы соответствуют наличию или отсутствию конкретного организма, а интенсивность полосы отражает численность организма.
Рисунок 8. Бактериальные профили 461 бактериального таксона (около 300 видов), сравнивающие поддесневой налет на 105 здоровых участках у пациентов со здоровым пародонтом (п=20) (левая панель) и 1 54 пораженных участков у больных пародонтитом (n=47) (правая панель).
Рисунок 9. Анализ соответствий (АС) поддесневого налета бактериальных сообществ на здоровых и пораженных участках. Каждый символ представляет одно сообщество с одного участка. Сообщества, которые ближе друг к другу, имеют более схожие профили МАМПРЧ. На этом рисунке здоровые участки у здоровых субъектов (зеленые кружки) отличаются от здоровых и пораженных участков у больных пародонтитом (красные символы).
Рис. 8 иллюстрирует формат штрих-кода МАМПРЧ, сравнивающий микробные профили около 300 видов бактерий из образцов у пациентов с пораженным и здоровым пародонтом. Эти данные могут быть дополнительно проанализированы для определения специфичности бактериальных ассоциаций (Colombo et al., 2009; Preza et al., 2009a, b) или взаимоотношения целых микробных популяций в условиях здорового и пораженного пародонта с помощью анализа соответствий, как показано на рис. 9.
Заметное различие в общей бактериальной структуре популяции этих двух наборов данных наглядно подтверждает результаты культуральных микробиологических исследований, выполненных около 30 лет назад, и согласуется с полученными в исследовании данными о дисбиозе микробиоты в качестве определяющего признака заболевания пародонта.
Кроме того, что эти результаты существенно улучшили понимание микробиома полости рта, они также выявили вероятность присутствия еще множества малочисленных видов, которые остаются незамеченными при использовании стандартных подходов, в основном из-за относительно затратной по времени и кропотливой методики. Эта проблема сейчас решается путем применения глубоких методов секвенирования, в частности технологий пиросеквенирования, которые позволяют обеспечить более полный охват последовательностей 16S рРНК в большом количестве образцов.
