Микробные биопленки состоят из одного или нескольких сообществ микроорганизмов, погруженных в матрикс, состоящий в основном из углеводов, который, в свою очередь, прикреплен к твердой поверхности. Биопленки позволяют микроорганизмам удерживаться и размножаться на поверхностях. Таким образом, прикрепленные «сидячие» бактерии, растущие в составе биопленки, обладают широким диапазоном характеристик, которые обеспечивают им ряд преимуществ по сравнению с одиночными свободно плавающими бактериями. Взаимодействие между видами бактерий, живущих в биопленке, происходит на нескольких уровнях, включая физический контакт, метаболический обмен, малую сигнальную молекулярно-опосредованную связь, иначе известную как «чувство кворума», и обмен генетической информацией (Kolenbrander et al., 2006; Newman & Wilson, 1999; Socransky & Haffajee, 2002; Marsh, 2005). Более подробное описание зубного налета как биопленки дано в отдельной статье на сайте.
Ключевая характеристика биопленки — прикрепление микроколоний внутри биопленки к твердой поверхности. Таким образом, адгезия к поверхности служит важным первым шагом в развитии биопленки. В ротовой полости есть много поверхностей куда могут прикрепляться бактерии в том числе мягкие ткани полости рта, зубы, покрытые тонкой слюнной пленкой и другими бактериями, а также ортопедические конструкции такие как протезы и имплантаты. Многие виды бактерий обладают поверхностными структурами, такими как фимбрии и фибриллы, которые помогают им прикрепляться к различным поверхностям.
Фимбрии были обнаружены у ряда оральных видов, в том числе A. naeslundii, Р. gingivalis, A. actinomycetemcomitans и некоторых штаммов стрептококков, таких как Streptococcus salivarius, Streptococcus parasanguinis и представителей группы Streptococcus mitis. Фибриллы могут быть найдены у представителей целого ряда бактериальных видов полости рта. Они морфологически отличаются и короче, чем фимбрии, и могут располагаться на поверхности клетки более или менее плотно. Бактериальные виды полости рта, которые обладают фибриллами, включают S. salivarius, представителей группы S. mitis, Р. intermedia, Р. nigrescens и Streptococcus mutans.
В случае зубного налета обширный микроскопический анализ, проведенный в течение последних 50 лет ex vivo, ясно свидетельствует, что существует очень упорядоченная структура в биопленках, прикрепленных к поверхности зуба. Часть наддесневого зубного налета с полимерных коронок добровольных участников исследования показана на рис. 12, a (Listgarten et al., 1975; Listgarten, 1976, 1999).
Срез демонстрирует многие из характерных особенностей биопленки, описанных ранее. Бактериальные клетки, прикрепленные к твердой поверхности, размножаются и, на этом срезе формируют столбчатые микроколонии. Неоднородность колонизирующих видов заметна даже на морфологическом уровне, и, тем не менее, существует четкая модель организационной структуры этих бактериальных масс. В поверхностных слоях биопленки наблюдаются морфотипы, которых не видно в более глубоких слоях, что, возможно, свидетельствует о роли бактериальной сукцессии в развитии сложной микробиоты и возможной роли co-агрегации в развитии биопленок. На данном препарате не видно, существуют ли водные каналы в биопленке, которые, как считается, присущи большинству биопленок в природе. Это может быть связано с артефактами обработки или фиксации (Costerton и др., 1999).
Водные каналы в зубном налете в полости рта человека наблюдались при просмотре с помощью конфокальной микроскопии (Wood et al., 2000). Зубная биопленка имеет все свойства биопленок в других местах обитания в природе. Она имеет твердый субстрат, в данном случае полимерную коронку, но в большинстве случаев зуб, смешанные микроколонии, растущие в гликокаликсе, и объемножидкостную границу, создаваемую слюной.
Рисунок 12. а — Гистологический срез наддесневой бляшки человека окрашивали толуидиновым синим — метиленовым синим. Наддесневая бляшка, выросшая в течение 3 дней на полимерной коронке у добровольца. Поверхность коронки находится слева, граница со слюной — справа. б — Гистологический срез поддесневой зубной бляшки человека окрашивали толуидиновым синим — метиленовым синим. Поверхность зуба находится слева, эпителиальная выстилка пародонтального кармана — справа. Бактериальный налет, прикрепленный к поверхности зуба, виден в направлении верхней левой части среза, в то время как вторая зона организмов, как можно наблюдать, выстилает зубодесневой карман.
Вторая экосистема биопленки, на этот раз поддесневой налет человека, показана на рис. 12, б. Срез показан при меньшем увеличении, чем на рис. 12, а, для визуализации областей в пределах биопленки. Бляшка, прикрепленная к поверхности зуба, видна в верхней левой части среза. Эта ассоциированная с зубом биопленка — продолжение биопленки, расположенной выше десневого края, и может содержать схожую микробную композицию. Вторая, возможно, связанная с эпителием биопленка может наблюдаться на выстилающей эпителиальной поверхности пародонтального кармана. Эта биопленка содержит в первую очередь спирохеты и грамотрицательные виды бактерий (Listgarten et al., 1975; Listgarten, 1976, 1999). P. gingivalis и T. denticola в большом количестве были обнаружены с помощью иммуногистохимического анализа в эпителиально-ассоциированной биопленке внутри зубодесневого кармана (Kigure et al., 1995).
Т. forsythia также может обнаруживаться в этой зоне в значительном количестве, так как с использованием ДНК-зондов была установлена высокая численность этого вида в ассоциации с эпителиальными клетками, выстилающими зубодесневой карман (Dibart et al., 1998). Между биопленками, ассоциированными с зубами и эпителием, может наблюдаться менее плотная зона микроорганизмов. Эти организмы, как правило, «слабо связаны» или находятся в свободном состоянии. Важная особенность поддесневой бляшки (см. рис. 12, б) — наличие областей, ассоциированных или с эпителием, или с зубом, а также возможно и третьей, слабо прикрепленной или вовсе неприкрепленной зоны микроорганизмов. Весьма вероятно, что эти области заметно различаются по микробному составу, физиологическому состоянию, а также по их реакции на различные методы лечения.
Среда обитания микроорганизмов, преобладающая в пределах биопленки, заметно отличается от условий жизни неприкрепленных организмов и оказывает значительное влияние на свойства постоянной микробиоты. Считается, что изменения, например, доступности питательных веществ, локальных значений pH и окислительно-восстановительного потенциала, а также присутствие бактерий, продуцирующих бактерицидные агенты для других видов и внутри- и межвидовые сигнальные молекулы, имеют решающее значение для изменения экспрессии генов «сидячих» бактерий по сравнению со свободноживущнми. Такое изменение экспрессии генов, влияющее на фенотип бактерий пародонта в биопленке, было продемонстрировано в ряде исследований.
К примеру, Lo et al. (2009) сравнили общую транскрипцию генов Р. gingivalis у свободно живущих и «сидячих» на биопленках организмов, выращенных в непрерывной культуре. Приблизительно 18% генома Р. gingivalis экспрессировалось иначе, когда бактерии выращивали в состоянии биопленки. Гены, экспрессия которых подавлялась в биопленке, участвовали в образовании клеточной оболочки, репликации ДНК, производстве энергии и биосинтезе кофакторов и простетических групп. С другой стороны, гены, кодирующие транспорт и связывающие белки, были активированы. Исследование также показало изменения в регуляции некоторых генов, кодирующих белки, участвующие в трансдукции сигнала и регуляции транскрипции, что могло иметь большое значение для регуляции роста биопленки.
Анализ общего протеома клеток Р. gingivalis, выращенных в аналогичных условиях, подтвердил значительные изменения в фенотипе бактерий при выращивании в биопленке (Ang et al., 2008). Подобные исследования в настоящее время осуществляются на смешанных культурах пародонтальных микроорганизмов, выращенных вместе в биопленке, чтобы определить влияние тесной связи между ними на закономерности экспрессии генов и белков (Zainal-Abidin et al., 2012).
Рисунок 13. Модели формирования биопленок in vitro. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия биопленки in vitro, окрашенной с использованием пары видоспецифичных антител, а — F. nucleatum (зеленый) плюс A. naeslundii (красный) после 15 мин роста, б — V. dispar (зеленый) плюс A. naeslundii (красный) после 16 ч. в — Сагиттальный срез — прямоугольная область на рис. б — показывает лежащие слоями микроколонии A. naeslundii; изображение растянуто в 1,5 раза вдоль оси x-z. Рисунок справа — идеализированное представление уложенных друг на друга микроколоний в виде фигуры волнообразных очертаний, г — S. sobrinus (зеленый) плюс F. nucleatum (красный) после 64 ч; стрелки указывают z-плоскость основного изображения, д — V. dispar (зеленый) плюс S. sobrinus (красный) после 40 ч. е — S. oralis после 40 ч. Стрелки указывают на клеточные мостики, связывающие микроколонии; прямоугольник в нижнем правом углу — увеличение внутриколониального моста (входящие в состав меченые парные виды не показаны).
Осознание глубоких изменений в свойствах бактерий в биопленке привело к разработке экспериментальных систем для изучения особенностей роста и биологических характеристик бактериальных популяций, выращенных в условиях прикрепления к поверхности. Пример одной такой системы, в данном случае с использованием смеси наддесневых и поддесневых микроорганизмов, показан на рис. 13. Формирование организованных структур микроколоний различных организмов с дискретной пространственной локализацией и наличием каналов, проходящих через эти структуры, сходно с особенностями микробной организации, наблюдаемой в естественных условиях в образцах зубного налета на рис. 12.
Модели такого рода, следовательно, вполне пригодны для изучения роста бактерий пародонта в смешанной культуре в состоянии биопленки для решения вопросов, имеющих отношение к развитию и накоплению зубного налета, а также к контролю его посредством антисептиков и антимикробных систем хозяина. Кроме того, при выращивании бактерий в условиях, имитирующих состояние естественной среды, биопленка обеспечивает получение экспериментально важных бактерий и бактериальных продуктов для дальнейшего фенотипического анализа и исследования вирулентности в системе in vitro.
