Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в исследовании ДНК
Методика блоттинга по Саузерну весьма трудоемкая и требует 5—10 мкг ДНК для исследования. Появление полимеразной цепной реакции (ПЦР) в значительной степени упростило анализ ДНК и уменьшило затраты лабораторного времени.
Как уже упоминалось, исследуемый ген составляет лишь небольшую часть последовательности всей хромосомной ДНК. Вместо выявления отдельного гена во всем гаплоидном геноме с помощью блоттинга по Саузерну ПЦР позволяет провести экспоненциальную амплификацию исследуемого гена так, что его структуру можно будет исследовать без ДНК-проб.
Для выполнения ПЦР нужны незначительные количества ДНК, обычно 0,1 — 1 мкг. Единственное требование ПЦР, отличающее ее от блоттинга по Саузерну, — необходимость знать точную последовательность гена или концов той области ДНК, которую нужно амплифицировать.
ПЦР состоит из трех последовательных этапов. На первом этапе (денатурации) ДНК нагревается до 94—95 °С, в результате чего образуются две однонитевые молекулы. Во время второго этапа (отжига, или присоединения праймеров) температура снижается до 37—55 °С. Реакционная смесь содержит праймеры — короткие фрагменты ДНК, обычно около 20—30 пар оснований в длину.
Каждый из двух праймеров точно комплементарен одному из концов двунитевой ДНК, которую необходимо амплифицировать. При снижении температуры праймеры присоединяются к комплементарным по строению участкам ДНК. Именно для создания комплементарных праймеров необходимо точно знать нуклеотидную последовательность ДНК, которую предстоит амплифицировать.
Праймеры добавляют с таким избытком, чтобы нити ДНК с большей вероятностью соединялись с праймерами, но не друг с другом. На третьем этапе (собственно синтез ДНК) температура повышается до 72 °С в присутствии фермента — термоустойчивой ДНК-полимеразы, например Taq-полимеразы и дезоксинуклеотидтрифосфатов, в результате чего к каждой из исходных нитей ДНК достраивается вторая (новая) нить ДНК по принципу комплементарности, синтез которой запустили праймеры.
На практике праймеры, буферный раствор, дезоксинуклеотидтрифосфаты, Taq-полимераза и образец исследуемой ДНК смешивают в пробирке объемом 25—100 мкл и помещают в прибор под названием амплификатор с терморегуляцией. Параметры инкубации и условия выполнения ПЦР определяют эмпирически для каждого набора праймеров.
После каждого цикла денатурации, отжига и синтеза комплементарной нити ДНК содержание этой молекулы в образце удваивается; однонитевой фрагмент ДНК становится двунитевым. Количество ДНК увеличивается экспоненциально, и итоговое ее количество составляет 2n, где n равно числу циклов. После 30 циклов (обычно в программу вводят такое число циклов) количество копий исследуемого гена может быть увеличено более чем в 1 млн раз.
После завершения ПЦР выполняют электрофорез в агарозном геле, при этом продукт мигрирует в определенную точку и образует отдельную полоску, которую окрашивают бромистым этидием с целью визуализации. Как правило, могут быть амплифицироваиы фрагменты ДНК размером несколько тысяч пар оснований, однако успешно осуществлена и амплификация фрагментов размером до 10 тысяч пар оснований.
