Блоттинг по Саузерну позволяет исследовать генетические нарушения на уровне ДНК. При выявлении нормального гена его можно использовать в качестве пробы (т. е. ДНК-пробы для сравнительного исследования структуры ДНК у конкретного человека).
Если исследуемая ДНК и ДНК-проба представлены одной нуклеотидной нитью и они комплементарны, то при их соединении должна произойти гибридизация (спаривание) молекул. Если же спаривание не произошло, то исследуемая ДНК не содержит генетической структуры, имеющейся в ДНК-пробе.
Для удобства исследуемая ДНК помещается на какой-либо подходящий материал, обычно нейлоновую мембрану. Такая методика называется блоттингом по Саузерну (Southern blot) в честь исследователя Е.М. Southern. Разработаны также модификации этого метода для исследования РНК (Northern blot) и белков (Western blot).
Блоттинг по Саузерну осуществляется в несколько этапов. Сначала из клеток выделяется ДНК; разумеется, клетки должны иметь ядро (лейкоциты, трофобласты). ДНК обрабатывается рестриктазой до неисчислимого количества небольших частей. Интересующий исследователя ген оказывается «раскидан» во множестве фрагментов, однако его точное местоположение и размер пока что определить невозможно.
ДНК переносится в агарозный гель, на который подается электрический ток. В процессе гель-электрофореза под влиянием электрического тока маленькие фрагменты ДНК двигаются быстрее и дальше, чем большие. Затем гель окрашивают бромистым этидием, который встраивается между парами оснований и позволяет видеть ДНК в ультрафиолетовом свете. Поскольку геномная ДНК человека огромна, на электрофоретической дорожке она выглядит как мазок, хотя в действительности состоит из множества отдельных фрагментов разного размера.
ДНК, содержащаяся в агарозе, на данный момент все еще представляет собой двойную спираль. Если обработать гель щелочью, ДНК денатурирует до одиночных нитей. После этого можно исследовать гель на гибридизацию с однонитевой ДНК-пробой, но в связи с хрупкостью геля ДНК обычно переносят па нейлоновую мембрану (блоттинг по Саузерну).
Гель помещают на платформу в контейнере, наполненном буферным раствором. Нейлоновая мембрана располагается непосредственно над гелем, поверх которой кладут бумажные салфетки. Буфер проходит через гель под воздействием капиллярной силы, вызывая миграцию однонитевой ДНК на нейлоновую мембрану. Затем мембрану обрабатывают в вакуумной печи для постоянного связывания ДНК с нейлоном. Время переноса может быть уменьшено за счет электроблоттинга или обработки вакуумом.
В итоге па нейлоновой подложке образуется пятно (blot), которое содержит набор образцов ДНК — исследуемых и контрольных. Эта ДНК может быть гибридизована с ДНК-пробами. Например, если предполагаемое заболевание — наследственная гиперплазия надпочечников вследствие делеции гена 21-гидроксилазы, исследование проводится с ДНК-пробой, комплементарной гену 21-гидроксилазы.
Перед гибридизацией ДНК-пробу метят каким-либо маркером, обычно радиоизотопом, например 32P, хотя используют не только радиоактивные вещества, а например, биотин-авидин. Если проба представляет собой двунитевую ДНК, ее денатурируют (расщепляют на две нити) кипячением или обработкой щелочью. После того как проба помечена и денатурирована, ее растворяют и помещают в пакет или пробирку с мембраной для гибридизации. После завершения этого этапа несвязавшуюся ДНК-пробу отмывают, чтобы удалить как можно больше неспецифических молекул.
При промывке при высокой температуре и низкой концентрации клеток остаются связанными только комплементарные последовательности. После этого мембрану помещают в пластиковый конверт внутрь кассеты, содержащей фотопленку, при температуре —70 °С. После «проявки» становится видно наличие или отсутствие полосок на пленке. Если в образцах больного и здоровых индивидуумов (контроль) полоски одного и того же размера и в одинаковом количестве, значит, ген в исследуемой ДНК сохранен и не имеет явных нарушений.
Но это не говорит об отсутствии небольших мутаций, как, например, замена одной пары нуклеотидов. Блоттинг по Саузерну не позволяет выявлять столь малые мутации, если только они не затрагивают области расщепления ДНК рестриктазой.
