Определение витамина В12 в сыворотке бактериологическим методом с помощью Lactobacillus leishmanii - методика, показатели нормы
Принцип определения витамина В12 в сыворотке. L. leishmanii это микроорганизм, несплособный синтезировать витамин В12. Если в подопытную среду, лишенную витамина В12, в которой добавлена проба сыворотки, ввести эту лактобациллу, то рост ее (измеренный турбидиметрическим способом) пропорционален количеству витамина В12, содержащегося в исследуемом материале.
Материалы для определения витамина В12 в сыворотке с помощью Lactobacillus leishmanii. Микроорганизмы для испытания: Lactobacillus leishmanii (N.C.I.В. 7884).
а) Раствор А, в состав которого входят: кислый гидролизат казеина, в достаточном количестве для 2,7 г. общего азота; 10 г. гидрированного уксуснокислого натрия (или 6 г. ангидрного); 2,5 г. КН2Р04; 2,5 г. К2НР04; 100 мг триптофана; 100 мг. гидрохлористого цистеина; 10 мг. аденина; 10 мг. гуанина; 10 мг. урацила; 10 мг. ксантина; 20 мл солевого раствора Б; до 400 мл дистилированной воды.
Кислый гидролизат казеина и соли перемешать с частью дистилированной воды, подогреть до 70°С и отфильтровать. Далее добавить отмеченные количества триптофана, цистеина и аденина (предварительно растворенные в небольшом количестве .N-раствора НО), затем гуанина, урацила и ксантина (растворенные в небольшом количестве B-раствора NaOH). Дополнить дистилированной водой до 400 мл.
б) Раствор Б (солей) состоит из: 10 г. MgS04. 7H20; 0,7 г амииачного железистого сульфата; 2 г. MnS04.4H20; 1 мл концентрированной соляной кислоты; до 250 мл дистилированной воды.
в) Раствор В (с витаминами), образованный из: 5 мг. гидрохлористого анеурина; 10 мг. пиридоксина; 5 мг, пиридоксала; 5 мг пиридоксамина; 1 мг парааминобензоиной кислоты; 5 мг рибофлавина; 5 мг. никотиновой кислоты; 5 мг. пантотената кальция; 5 мг птероилглютамовой кислоты; 20 мл дистилированной воды. (Раствор запечатывается в ампулы, вместимостью 1 мл, которые хранятся на холоде).
г) Полная основная среда (концентрации 5/3 от конечной концентрации) в достаточном количестве для 5 проб (дополнительно нормальная сыворотка и стандартные растворы) состоит из: 200 мл раствора А; 1 мл раствора В (с витаминами); 10 г глюкозы; 250 мг тиомаликовой кислоты; 62,5 мг натриевой соли гуанилиновой кислоты; 0,5 мл Tween 80; 0,5 г фенобарбитурата натрия; 2 мл раствора биотина из расчета 1 мкг/мл; до 300 мл дистилированной воды. (Глюкозу, гуаниловую кислоту и фенобарбитурат натрия развести в дистилированной воде и влить в смесь, перед дополнением объема до 300 мл).
д) Витамин В12 в виде раствора из расчета 50 мкг/мл (для приготовления стандартных растворов). Вымерить точно 1 мл (шприцем для туберкулина), налить в градуированный баллон вместимостью 50 мл хранить в рефриясераторе до 3 месяцев.
е) Раствор цианида натрия + буфер-ацетат (для испытания сыворотки). Приготовление: 20 мл 0,1% раствора NaCN, 50 мл буфера-ацетат натрия 0,4 М, с показателем водорода 4,5 и до 1000 мл дистилированной воды.
ж) Лабораторная посуда: пробирки 150 х 16 мм с алюминиевыми крышками; градуированная колба на 50 мл; 6 градуированных колб, на 20 мл каждая; 2 градуированные пипекти, по 5 мл; 2 градуированные липетки по 1 мл; 2 микропипетки по 0,1 мл; градуированные цилиндры, на 500, 250 и 50 мл; большая пробирка; колбы Эрленмайерана 500 и 200 мл.
Приобрести новую стеклянную посуду, исходно обработать ее на теплоте 10% азотной кислотой, хорошо прополоскать дистилированной водой и хранить лишь для определения витамина В12 (также материалы, используемые для чистки посуды); алюминиевые крышки прокипятить в воде с детергентом, затем прополоскать дистилированной водой; между двумя определениями, чистить лишь кипячением и полосканием.
Техника определения витамина В12 в сыворотке с помощью Lactobacillus leishmanii
1) Приготовление проб для испытания: отобрать у больного, без противосвертывающего вещества, количество крови (примерно 5—10 мл), с расчетом получения 2 мл сыворотки; осветлить после ретракции сгустка; когда определение проводится позже, сыворотку сохранять замороженной (при —20°С).
2) Подготовка предназначенного к исследованию микроорганизма. Исходно культуру микроорганизма проводить на 5 мл простой концентрированной основной среде, к которой добавить 1% растворимого протеолизата печени; после однодневной инкубации (18 ч) процентрифугировать, осветлить надосадочную массу; повторную взвесь бактериального осадка в оставшейся среде слить в стерильные ампулы, для образования запаса.
Культуры, предназначенные для определения, проводить на твердой среде, приготовленной из среды с протеолизатом печени и 1% агара (преимущество твердой среды заключается в том, что делает возможным контроль чистоты).
Приготовление материала для инъецирования. С твердой среды одну колонию впрыскнуть в 5 мл жидкой среды с протеолизатом печени; после 18-часовой инкубации процентрифугировать, осветлить надосадочную массу, осадок, трижды промыть стерильной дистилированной водой и образовать повторную суспензию в 5 мл стерильной дистилированной воды; 0,1 мл этой взвеси ввести в 5 мл простой концентрированной основной среды и оставить 18 часов для аэробной инкубации; далее из этой нераз-веденной культуры повторно ввести по 0,1 мл в два участка по 5 мл той же среды и еще раз подвергнуть 6-ти часовой инкубации. Таким способом получим однородный препарат для инъецирования с одинаковым вырастанием.
3) Техника испытания. По окончании приготовления полной основной среды (концентрация 5/3) приступить к приготовлению сывороточных экстрактов. Для этого, с помощью градуированной пипетки отметить 1 (или 2) мл сыворотки; из крупной пипетки добавить 19 (или 18) мл раствора цианида натрия + буфера-ацетат (получим разведение 1:20 или 1:10); заложить в автоклав на 30 мин., при давлении 2 атмосфер.
Приготовление стандартных растворов витамина В12. В целях получения стандартных растворов концентрации 25, 50, 100, 200, 400, 800 пг/мл развести 1 мл витамина В12 50 мкг/мл в дистилированной воде из расчета 1:50 (в градуированной колбе на 50 мл), затем в шесть градуированных колб на 20 мл каждая влить 0,5, 1, 2, 4, 8 и 16 мл и дополнить дистилированной водой. Далее по 1 мл этих растворов обработать подобно сывороточным пробам.
Приготовление пробирок для испытания. Набор проб слагается из 5 сывороточных проб для испытания, одной сывороточной нормальной (контрольной) и 6 стандартных растворов витамина В12. Определения проводить в двух экземплярах.
С помощью крупной пипетки влить в каждую пробирку по 15 мл основной среды (5/3), заложить в автоклав на 6 мин. при давлении 4 атмосфер; добавить по 10 мл автоклавированной сыворотки или стандартного раствора витамина В12, а затем по 0,5 мл приготовленного в течение 6 часов материала для инъецирования; хорошо взболтать для гомогенизации. В четыре стерильные пробирки влить (стерильными пипетками) по 15 мл инъецированной среды (без материала, содержащего витамин В12), в качестве контрольного препарата на стерильность.
Инкубацию провести в посуде для вакуума, из которой удаляется воздух (с помощью насоса для вакуума) и вводится водород. Этот метод обеспечивает более однородное и одинаковое развитие; продолжительность инкубации 36 часов.
Определение развития бактерий осуществляется турбидиметром с нефелометром (возможно фотометрическим путем), результаты получаются интерполяцией на стандартной кривой, построенной по значениям стандартных растворов В12.
Толкование результатов определения витамина В12 в сыворотке с помощью Lactobacillus leishmanii
Проще и быстрее прочих микробиологических способов метод, использующий L. leishmanii дает близкие к ним результаты, с хорошим воспроизведением. Нормальные значения колеблятся от 200 до 900 пг/мл.
При недостатке витамина В12 значения меньше 100 пг/мл, в то время как высокие наблюдаются у страдающих хронической гранулоцитной лейкемией (до нескольких тысяч пг/мл), после инъецирования В12, а иногда при отдельных заболеваниях печени. Метод не применять больным, проходящим курс лечения антибиотиками (угнетающими развитие микроорганизма).
