Определение метилмалоновой кислоты в моче - методика, показатели нормы
Принцип определения метилмалоновой кислоты в моче. Метилмалоновая кислота изолируется из мочи с помощью ионообменивающей смолы Dowex 3 X 4. В контакте с двуазотистым паранитроанилином окрашивается в зеленый цвет, яркость которого измеряется спектрофотометром, при 620 ммк. а затем сопоставляется с интенсивностью эталона метилмалоновой кислоты.
Материалы для определения метилмалоновой кислоты в моче: стандартный раствор метиломалоновой кислоты 0,05 М (приготовляется из 295 мг метилмалоновой кислоты в 50 мл дистилированной воды); Dowex 3x4 (хлорноватая форма, 200—400 mesh; трижды промывается 5 объемами дистилированной воды, суспендируется в 2 объемах дистилированной воды и хранится в бутылках темного цвета при +4°С); буфер-ацетат с показателем водорода 4,3 (приготовляется из раствора 1М уксуснокислого натрия и 1М уксусной кислоты); паранитроанилин (приготовляется 0,075% раствор, растворением 375 мг реагента в 500 мл 0,2 N соляной кислоты; раствор сохраняется в бутылке темного цвета, в комнатной температуре в течение нескольких месяцев); 0,5% раствор нитрита натрия (NaNО2); раствор 2M уксуснокислого натрия; 0,1 N и 0,2 N раствора соляной кислоты; 3N раствор гидрата окиси натрия.
Реагент диазо приготовить в день испытания. Для этого, в условиях комнатной температуры, перемешать 4 мл 0,5% раствора NaNО2 и 15 мл 0,075% раствора н-нитроанилина; после охлаждения в ванне со льдом добавить 4 мл 2М раствора уксуснокислого натрия; препарат устойчив сутки при комнатной температуре.
Техника определения метилмалоновой кислоты в моче
Пробу мочи, собранную в пластмассовом флаконе, храненную в замороженном состоянии, без добавления консервирующих средств, разморозить и добавлением NaOH или НО довести до показателя водорода 6,5; возможную взвесь каких-либо материалов устранить подогревом или центрифугированием.
Для хроматографии взвесь Dowex 3x4 (хлорноватая форма) поместить в колонку 1 х 20 см, к которой приспособить резервуар на 200 мл, затем приготовить плотную колонку, величиной 3 см, для этой цели использован вакуумный насос; влить 5 мл из пробы мочи и дважды промыть смолу, для чего каждый раз использовать по 50 мл дистилированной воды, при этом соблюдать скорость стекания 5—15 мл/мин. (можно использовать вакуумный насос, обеспечивающий желаемую скорость стекания); элюировать метилмалоновую кислоту с поверхности смолы 20 мл раствора ОД N соляной кислоты, путем гравитации.
Для цветной реакции в пробирке, величиной 2 х 15 см, замешать 2 мл элюата и 3 мл буфера-ацетат (показатель водорода 4,3), добавить 3 мл холодного реагента диазо и привести показатель водорода до 4,0; подогреть смесь в течение 3 минут в ванне с водой при температуре 94°С и добавить 2 мл 3N раствора NaOH; вынуть пробирки из воды, закрыть ватными пробками (во избежание контакта с атмосферным СО2), прогомогенизировать и оставить 10 минут для охлаждения в комнатной температуре.
Каждый набор проб сопровождается контрольной пробой реагента (содержащей 2 мл 0,1 N раствора НСl 1+3 мл реагента диазо +3 мл буфера), также стандартной пробой (дополнительно содержащей 0,02 мл 0,05 М метилмалоновой кислоты).
Колориметрия осуществляется определением оптической плотности в участке 620 нм спектрофотометра, для чего использовать баки толщиной 1 см.
Расчет результата (при описанной технике) делать по следующей формуле:
метиломалновая кислота/л. мочи = оптич. плотн. пробы (с поправокй) х 236 / оптич. плотн. стандарта (с поправкой)
(для поправки оптической плотности пробы вычесть значение оптической плотности контрольной пробы).
Толкование результатов определения метилмалоновой кислоты в моче
В зонах малых значений (соответствующих нормальным значениям — от 1 до 7 мг/сутки) коэффициент погрешности высокий (примерно ±72%); когда же речь идет о высоких значениях, этот коэффициент укладывается в пределы от 4 до 15%. Наличие иных веществ, способных реагировать в присутствии реагента диазо (кетоновые тела, мочевина и пр.) задерживаемые Dowex 3x4, не оказывает существенного влияния на результат.
При недостатке витамина В12 выделение малоновой кислоты с мочой растет от нескольких десятков мг. до более 1000 мг/сутки. В большинстве случаев эти значения быстро понижаются после лечения витамином В12.
