Цитология: блокирование митоза на метафазе и дисперсия хромосом
Блокирование митоза на метафазе. Чаще применяемые митостатические средства относятся к типу колхицина. Способ введения, концентрация и время воздействия колеблятся в зависимости от препарата и техники.
Так, Bottur рекомендует прижизненное прекращение митоза на метафазе путем внутривенного инъецирования колцемида США или сульфата винбластина (0,1 мг/кг веса тела), за два часа до отбора костномозговой ткани. Поскольку это не применимо во всех случаях, отдается предпочтение использованию митостатического средства в пробирке, при этом инкубация проводится в разное время либо со свежей тканью, либо с клеточной культурой.
Используются следующие митостатические препараты, растворенные в забуференном солевом растворе: кристаллизованный колхицин — окончательной концентрации 0,1—0,2 мкг/мл, время воздействия 1,5—3 часа; кольцемиде CIBA — окончательной концентрации 0,2 мкг/мл, время воздействия 3 часа; сульфат винбластина — окончательной концентрации 0,005 мкг/мл, время воздействия 3 часа.
Слишком большая концентрация или продолжительное воздействие могут изменить аспект хромосом: неясное очертание, преметафазное отделение центромеров. Вот почему отдельные авторы избегают применение митостатических средств, когда тканевой митоз характеризуется высоким показателем.
Дисперссия хромосом
Четкое наблюдение хромосом достигается гидролизацией цитоплазмы и их дисперссией с помощью гипотонического раствора. Чаще применяются следующие способы: 0,75—0,95 г% раствора лимонокислого натрия, инкубация при 37°С, 10—20 мин.; 0,50 г% водного раствора хлорида калия, инкубация при 20°—37°С, 8—15 мин.; одна часть раствора Hanks на три части дистилированной воды, инкубация при 37°С в течение 8—10 мин. На этом этапе обращение деликатное, время центрифугирования сокращенное (5 мин.).
Закрепление мазка. Постоянные и качественные препараты достигаются закреплением, с помощью закрепляющего средства Carnoy, состоящего из трех частей абсолютного древесного спирта и одной части ледяной уксуснй кислоты. Закрепитель должен быть свежеприготовленным из растворов, сохраненных при температуре 4°С.
Клетки продержать в закрепителе 30—45 мин., при одинаковой температуре. Закрепление повторять, наливая несколько раз свежий закрепитель. При последних закреплениях менять отношение смеси — 3/2; в таком растворе хромосомы можно сохранять несколько дней.
