Фагоцитарная активность дендритных клеток. Иммунофенотип дендритных клеток
Дендритные клетки, полученные из клеток костного мозга мышей, были протестированы на способность к фагоцитозу. Фагоцитарную активность ДК на различных стадиях дифференцировки, активированных Иммуновак-ВП-4, АСО и классическим индуктором созревания TNF-a, оценивали по поглотительной способности в отношении штаммов S. aureus и S. typhimurium. В качестве контроля были использованы макрофаги, которые получали из тех же клеток костного мозга, путем культивирования их с GM-CSF в течение 7 суток.
Незрелые дендритные клетки более активно фагоцитировали бактерии в отличие от ДК, обработанных Иммуновак-ВП-4, АСО и TNF-a.
Фагоцитарная активность макрофагов и дендритных клеток была в динамике изучена в отношении S. aureus и S. typhimurium.
Наиболее активными были макрофаги, фагоцитарный индекс у них по отношению к S. aureus уже через 30 мин инкубации составлял 86,0±4,8 %, и он оставался на высоком уровне в течение трех часов наблюдения.
Фагоцитарная активность незрелых ДК и стимулированных иммуномодуляторами микробного происхождения значительно отличались.
При добавлении в среду культивирования TNF-a или Иммуновак-ВП-4 (группы 2 и 3) фагоцитарная активность была существенно ниже, причем при прибавлении Иммуновак-ВП-4 фагоцитарный индекс был несколько выше, чем в случае созревания ДК под влиянием TNF-a. Под воздействием АСО также отмечалось снижение фагоцитоза ДК, однако его уровень был выше по сравнению с Иммуновак-ВП-4, что может свидетельствовать о наличии в культуре незрелых ДК и макрофагов. При сопоставлении степени фагоцитоза S. aureus и S. ty-phimurium существенных различий не выявлено.
Вполне вероятно, что более высокая активность поглощения бактерий дендритными клетками, стимулированными Иммуновак-ВП-4 и АСО, обусловлена экспрессией Toll-подобных рецепторов на ДК и макрофагах, которые обладают сродством к патоген-ассоциированным структурам бактерий. После взаимодействия с бактериальными продуктами, ДК переходят в новое функциональное состояние, выражающееся в снижении фагоцитарной активности и способности к более мощной презентации антигена по сравнению с макрофагами.
Изучение иммунофенотипических характеристик дендритных клеток на разных стадиях их созревания проводили с использованием флюоресцеинизотиоцианат и РЕ-меченых моноклональных антител фирмы «Caltag», США.
Степень дифференцировки и зрелости дендритных клеток, полученных из клеток эмбриональной печени мышей, определяли по изменению уровня экспрессии дифференцировочных молекул CD34, CD38, CD40, CD80, CD86, CD83, F4/80, МНС I, МНС II через 3 суток после добавления к незрелым дендритным клеткам Иммуновак-ВП-4, бактериального лизата К. pneumoniae или TNF-a.
Полученные данные свидетельствуют о том, что TNF-a и Иммуновак-ВП-4 в исследуемых концентрациях стимулировали созревание ДК. Однако, судя по экспрессии дифференцировочных маркеров, TNF-a активировал созревание ДК в большей степени, чем Иммуновак-ВП-4 и лизат К. pneumoniae. Концентрация 25 мкг/мл Иммуновак-ВП-4 оказалась оптимальной для индукции созревания ДК; в этих условиях уровень экспрессии костимулирующих молекул был более высоким. Однако экспрессия Р4/80-молекул на ДК, стимулированных Иммуновак-ВП-4 и лизатом К. pneumoniae, оставалась повышенной (23,8±2,6 % и 21,2±3,4 %, соответственно) по сравнению с ДК, обработанными TNF-a (0,6±0,2 %).
Был исследован также иммунофенотип дендритных клеток, полученных из клеток костного мозга мышей. В качестве индукторов созревания использовали иммуномодуляторы бактериального происхождения — Иммуновак-ВП-4, ГМДП, АСО, а в качестве контроля — лизат и ЛПС К. pneumoniae и TNF-a.
Активация клеток с помощью Иммуновак-ВП-4 и ГМДП приводила к созреванию клеток. Усиливалась экспрессия костимулирующих молекул, адгезивной молекулы CD38. При этом используемые концентрации Иммуновак-ВП-4 по-разному влияли на уровень МНС. При дозе 25 мкг/мл экспрессия МНС I была в 2,7 раза больше, чем при концентрации 50 мкг/мл. Экспрессия МНС II была высокой при обеих дозах и не имела существенных отличий. ГМДП увеличивал содержание ДК, экспрессирующих МНС II класса.
Использование лизата и ЛПС К. pneumoniae повышало уровень экспрессии костимулирующих молекул, молекул антигенного представления МНС I и II.
При использовании АСО в качестве индуктора созревания ДК экспрессия маркера CD34 претерпевала существенные изменения в зависимости от дозы. Его динамика отмечена только при максимальных дозах. При применении АСО в дозе 0,3 ЕС/мл увеличивалось содержание CD80, CD86, МНС I экспрессирующих клеток. Однако уровень CD86 был ниже, чем при использовании других индукторов созревания. Экспрессия маркера F4/80 на ДК, стимулированных Иммуновак-ВП-4, может быть связана с присутствием в вакцине бактериальных ЛПС. Эти результаты подтверждаются полученными ранее данными о способности ДК, обработанных ЛПС, экспрессировать не только антигены зрелых ДК, но и рецепторы к ЛПС.
В следующих экспериментах изучали экспрессию этих маркеров при комбинации имммуномодуляторов микробного происхождения (ИММП) с TNF-a. Культивирование ДК в присутствии GM-CSF и IL-4 с добавлением на шестые сутки 2,5 нг/мл TNF-a и ИММП стимулировало созревание ДК в большей степени, чем эта доза TNF-a, и снижало в культуре содержание макрофагов. Сам по себе TNF-a в концентрации 2,5 нг/мл (группа 3) не вызывал созревания ДК по сравнению с контролем (группа 2), маркер незрелости CD34 был выше в 5 раз, F4/80 — в 11,4 раза, что свидетельствует о наличии в культуре существенного процента макрофагов. Однако при коинкубации 2,5 нг/мл TNF-a с иммуномодуляторами происходило увеличение экспрессии адгезивной молекулы CD38, костимулирующих молекул CD40, CD80, CD86, а также МНС I и II класса.
Особенно это касается АСО, поскольку коинкубация его с TNF-a стимулировала экспрессию поверхностных маркеров, присущих ДК. При этом снижался маркер CD34 по сравнению с незрелыми ДК (группа 1) в 3,4 раза, увеличивалась экспрессия адгезивной молекулы CD38 в 3,2 раза, костимулирующих молекул CD40 в 38 раз, CD80 и CD86 почти в 9 раз, МНС I в 2,7 и МНС II в 1,5 раза, уровень макрофагального маркера снижался в 3,6 раза. При внесении в среду культивирования TNF-a и Иммуновак-ВП-4 также выявлена стимуляция эффекта, выразившегося в том, что существенно увеличилась экспрессия МНС I и II и снизилось содержание F4/80 по сравнению с действием Иммуновак-ВП-4 в той же дозе (табл. 7). Близкие результаты получили при комбинации TNF-a (2,5 нг/мл) и ГМДП, но экспрессия CD40, CD80, CD86 и МНС II была больше в случае комбинации TNF-a и Иммуновак-ВП-4.
Полученные данные свидетельствуют, что внесение в среду культивирования небольшого количества TNF-a повышает потенциал созревания ДК под воздействием иммуномодуляторов микробного происхождения.
