Диагностика дистрофинопатий. ДНК диагностика миодистрофий
В редких случаях заболевание в своем развернутом виде может манифестировать у женщин, являющихся гетерозиготными носительницами мутантного гена; это наблюдается при хромосомных транслокациях и перестройках, затрагивающих критический хромосомный сегмент Хр21, при синдроме Тернера (генотип ХО), а также при несбалансированной инактивации Х-хромосом в раннем эмбриогенезе [Griggs R., Fischbeck К., 1992; Specht L., Kunkel L., 1993].
Во всех указанных случаях наличие мутантного гена на одной из Х-хромосом не компенсируется нормальным геном гомологичной хромосомы, что и приводит к появлению типичных симптомов болезни у женщин.
«Золотым стандартом» при постановке диагноза дистрофинопатий является исследование мышечной ткани на дистрофии (иммуногистохимический анализ, иммуноблоттинг). Этот метод, однако, весьма дорог, технически сложен и требует проведения биопсии мышцы. Поэтому в настоящее время широко применяется неинвазивная диагностика ПМД Дюшенна/Бекера с использованием различных молекулярно-генетических подходов на клетках крови.
Наиболее простым методом ДНК-диагностики дистрофинопатий является так называемая мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР [Chamberlain J. et al., 1988]. Она заключается в одновременной амплификации набора наиболее часто мутирующих экзонов гена дистрофина; при электрофорезе продуктов реакции отсутствие одного или нескольких экзонов будет свидетельствовать о делеции, т.е. служить молекулярным подтверждением диагноза [Chamberlain J., et al, 1988; Multicenter Study Group, 1992].
Комбинированное использование нескольких мультиплексных реакций позволяет диагностировать до 98% всех делеций, имеющих место у больных ПМД Дюшенна/Бекера [Beggs A. et al., 1990]. На рисунке показан пример прямой ДНК-диагностики мышечной дистрофии Дюшенна при мультиплексной ПЦР (выявление различных делеций в гене дистрофина).
Для диагностики носительства мелких или редких делеций в гене дистрофина, а также при наличии других типов мутаций (вставки и дупликации, точковые мутации) могут применяться более сложные методы ДНК-анализа, такие как Саузерн-блоттинг с использованием кДНК-зондов, SSCP- и гетеродуплексный анализ отдельных экзонов гена, различные методы исследования кДНК, полученной из лимфоцитов или мышечных биоптатов с помощью обратно-транскриптазной ПЦР, а также ряд других подходов [Darras В. et al, 1988; Forrest S. et al, 1988; Roberts R. et al, 1992; Prior T. et al, 1994; Tubiello G. et al, 1995; van Essen A., 1997].
Важно отметить, что указанные ДНК-методы не только значительно повышают процент выявляемости мутаций в гене дистрофина у обследуемых больных, но и позволяют осуществлять диагностику мутаций у женщин-носительниц (последнее невозможно при проведении мультиплексной ПЦР, поскольку у женщин-носительниц делеция на мутантной хромосоме «маскируется» наличием нормального экзона, амплифицируемого с другой Х-хромосомы).
