Цитология, гистология заживления костных ран и влияние формы имплантатов на регенерацию
а) Гистодинамика заживления костных ран. Как уже отмечалось, остеоинтеграция предполагает образование структурного и функционального соединения между костной тканью и имплантатами, что обеспечивает долгосрочную стабильность и их самих, и опирающихся на них протезов. На процесс достижения остеоинтеграции влияют такие факторы, как характеристики костной ткани на конкретных участках, протокол препарирования ложа, выраженность хирургической травмы, макро- и микротекстура имплантата. Многие из этих параметров были изучены на животных моделях, чтобы понять их влияние на остеоинтеграцию.
В 1980 г. Osborn и Newesley предложили дифференцировать контактный и дистантный остеогенез, чтобы характеризовать остеоинтеграцию относительно поверхности имплантатов без учета происходящих биологических механизмов. Позднее Davies и соавт. изучили in vitro последовательность процессов, происходящих на границе между костью и имплантатом.
При дистантном остеогенезе формирование костной ткани начинается от стенок костного ложа: клетки, обладающие остеогенным потенциалом, постепенно образуют новый костный матрикс вокруг имплантата (рис. 1а). Контактный остеогенез характеризуется скоплением остеогенных клеток непосредственно на поверхности имплантата, т.е. на удалении от костных стенок (рис. 1b).
Несмотря на то, что и контактный, и дистантный остеогенез приводит к образованию костной ткани вокруг имплантатов, происходящие при этом биологические процессы отличаются. Кроме того, большое значение имеют морфологические особенности и характеристики поверхности имплантата. В частности, в области относительно гладких их участков превалирует дистантный остеогенез, в то время как на более шероховатых наблюдаются оба его варианта.
По мнению Davies, контактный остеогенез можно разделить на три этапа:
• остеокондукция;
• остеогенерация;
• остеоинтеграция.
1. Остеокондукция. Остеокондукция обусловлена движением к поверхности имплантата мезенхимальных стволовых клеток (МОК). Они проникают в кровяной сгусток, сформированный между имплантатом и костью, после чего дифференцируются в костные клетки.
Препарирование ложа для имплантата приводит к нарушению микроциркуляции и кровотечению на ограниченном участке кости, что инициирует коагуляцию и формирование фибринового сгустка.45 Кроме того, в результате локальной ишемии развивается некроз слоя костной ткани на удалении не более 0,1 мм от капилляров. Процесс хемотаксиса, обусловленный влиянием ряда факторов, в том числе тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), а также тромбина, продуктов тканевого распада, ведет к скоплению в сгустке лейкоцитов. В ходе заживления сначала в ране преобладают нейтрофилы, однако довольно быстро становится больше макрофагов.
Цитокины играют важную роль не только в устранении воспаления, но и в восстановлении поврежденных тканей. PDGF ускоряет митоз фибробластов и костных клеток, a TGF-β участвует в формировании коллагена I типа. Сразу после установки имплантата на его поверхности откладываются белки и другие макромолекулы, присутствующие в составе крови, затем в рану поступают клеточные элементы. Шероховатая поверхность имплантатов способствует остеокондукции, поскольку абсорбирует и удерживает макромолекулы (особенно тромбин и фибриноген), а также имеет большую площадь для прикрепления фибринового матрикса. Более того, шероховатая поверхность способствует адгезии эритроцитов и ассоциируется с увеличением количества и активацией тромбоцитов (рис. 2).
Рисунок 2. СЭМ: эритроциты и активированные тромбоциты среди волокон фибрина на поверхности Tillnite
В определенный момент в рану (т.е. непосредственно к поверхности имплантата) мигрируют клетки, обладающие остеогенным потенциалом, что ведет к реорганизации сгустка. Нужно отметить, что в ране преобладают тромбоциты и фибробласты, в то время как макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты обнаруживаются в меньшем количестве. Фибриновый сгусток постепенно уменьшается и, если сила потери объема превышает прочность его адгезии к титановой поверхности, отрывается от имплантата, что замедляет процесс остеоинтеграции. Прикрепление сгустка к имплантату является важнейшим условием миграции остеогенных клеток к поверхности последнего, а их текстура непосредственно влияет на адгезию сгустка.
Экспериментальные исследования не позволили выявить статистически значимые отличия в прочности прикрепления сгустка к поверхностям, которые были подвергнуты пескоструйной обработке и протравливанию кислотой.47 Тем не менее такая разница отмечалась между фрезерованной поверхностью и поверхностью с плазменным напылением титана.
2. Остеогенерация. Остеогенерация предполагает привлечение и активизацию клеток, обладающих остеогенным потенциалом. Такие клетки дифференцируются в остеобласты, которые непосредственно участвуют в образовании костной ткани (рис. 3).
Рисунок 3. Остеогенные клетки контактируют с поверхностью TiUnite и синтезируют остеоидный матрикс. Образованная костная ткань формируется на остеокондуктивной поверхности, образуя тонкий слой губчатой кости. Впоследствии эта ткань преобразуется в пластинчатую кость
Остеобластам присущи следующие характеристики:
• Остеобласты образуются из мезенхимальных клеток-предшественников, а их дифференциация завершается превращением в остеоциты.
• Остеобласты обладают высокой секреторной способностью; они синтезируют матрикс, состоящий в основном из коллагена I типа и костных белков, а также участвуют в минерализации матрикса.
• Остеобласты играют важную роль в аутокринной регуляции. Они синтезируют и накапливают факторы роста в костном матриксе, что очень значимо для репарации и ремоделирования.
• Остеобласты посредством системных и местных механизмов привлекают и активизируют остеокласты, которые, в свою очередь, участвуют в процессах репарации и ремоделирования.
Перед началом формирования костной ткани остеогенные клетки проходят несколько стадий: миграцию, адгезию, пролиферацию и дифференциацию.
2.1 Хемотаксис. Для образования костной ткани необходимо наличие достаточно большого количества остеобластов, которые происходят из мезенхимальных клеток костного мозга и клеточных слоев надкостницы и эндоста. Движение остеобластов обусловлено действием биологически активных молекул, например костных морфогенетических протеинов (КМП), на клетки-предшественники.
2.2 Адгезия. Адгезия остеобластов к имплантату зависит от его характеристик (микротекстура поверхности, химический состав, поверхностная энергия), которые влияют на дифференциацию клеток на нем.
Адгезия остеобластов к имплантату происходит в два этапа - это агрегация и собственно адгезия. Агрегация заключается в быстром скоплении остеобластов и развитии краткосрочных реакций, в том числе возникновении физико-химических связей между клетками и материалом (например, ионные связи и силы ван дер Ваальса). Адгезивное прикрепление образуется в течение длительного времени и требует участия ряда биологических молекул - белков внеклеточного матрикса. Эти молекулы взаимодействуют между собой и регулируют пролиферацию и дифференциацию остеобластов.
Как отмечалось ранее, на абсорбцию биоактивных молекул влияют микротекстура, химический состав и энергия поверхности имплантатов. По сути, именно эти молекулы осуществляют первый контакт между имплантатом и тканями организма. С точки зрения остеоинтеграции КМП являются обязательными элементами, связывающими кость с имплантатом, и опосредованно обеспечивают клеточную адгезию к его поверхности (рис. 4).
Рисунок 4. Остеобласты прикрепляются к титановой поверхности с помощью псевдоподий, перекрывая открытые поры.
2.3 Пролиферация. Известно, что пролиферация клеток зависит от целого ряда факторов и регулируется множеством цитокинов и факторов роста, гормонами, физическими и биохимическими стимулами.
2.4 Дифференциация. Для образования костного матрикса должна завершиться дифференциация остеобластов, уже имеющих к этому времени соответствующие характеристики секретирующих клеток. Нужно отметить, что 65-85% остеобластов погибает в результате апоптоза - запрограммированной смерти клеток, в то время как относительно небольшое их количество выживает и дифференцируется в остеоциты (14% в кортикальной и 29% в трубчатой кости). Данный процесс не является спонтанным, а регулируется гормонами, факторами роста, цитокинами, механической стимуляцией и физической деформацией. Сгусток, который формируется вокруг имплантата в первые часы после установки, в течение нескольких дней трансформируется и замещается грануляционной тканью, богатой нейтрофилами и макрофагами.
Пролиферация мелких кровеносных сосудов и продуцирование факторов роста остеоидными клетками ведут к формированию вокруг имплантата соединительной ткани. Затем в результате сочетанной деятельности остеокластов, фибробластов и остеобластов соединительная ткань трансформируется в остеоидную, которая в течение 8 недель замещается зрелой костной.
В целом образование костной ткани можно разделить на несколько этапов:
1) Абсорбция поверхностью имплантата неколлагеновых костных белков, прежде всего остеопонтина, костного сиалопротеина и протеогликанов.
2) Начало минерализации костных белков (формирование кристаллов фосфата кальция).
3) Первая минерализованная структура образуется непосредственно на поверхности имплантата при отсутствии коллагеновых волокон. Эта так называемая цементная прослойка имеет толщину 0,5 мкм и содержит кальций, фосфор, остеопонтин и костный сиалопротеин.
4) Коллагеновые волокна прикрепляются к цементной прослойке, образуя структуру для формирования костномозгового вещества. Однако сами волокна не прикрепляются к поверхности имплантата.
Образование костной ткани регулируют поляризованные остеобласты. В результате отложения матрикса на базальной поверхности клеток последние смещаются в апикальном направлении. В процессе кальцификации остеобласты быстро мигрируют, избегая включения в матрикс. Некоторые остеобласты остаются в толще костной ткани и трансформируются в остеоциты.
3. Остеоинтеграция. В течение нескольких недель после имплантации остеогенная активность наиболее высока, быстро происходят митоз и дифференциация мезенхимальных стволовых клеток (особенно в первые 15-20 дней). Сначала в пространстве между имплантатом и стенкой ложа формируется незрелая костная ткань, которая характеризуется хаотичным положением коллагеновых волокон, низкой минерализацией и отсутствием организации остеоцитов. Прочность и плотность незрелой кости уступают по этим характеристикам организованной пластинчатой костной ткани. Примерно через 10-14 дней после установки имплантата начинает формироваться биологическое прикрепление, которое отличается от чисто механического параметра первичной стабильности имплантата.
Формирование костной ткани продолжается 4-6 недель, сопровождаясь начальным ремоделированием. Через 8 недель остеогенная активность резко снижается, в то время как ремоделирование и структурная адаптация образованной кости достигают максимума. В результате повышается минерализация и появляется типичная пластинчатая структура костной ткани (рис. 5 и 6).
Рисунок 5. Гистологическая картина (в том числе в поляризованном свете) через 6 месяцев после имплантации подтверждает формирование кости
Рисунок 6. Остеокондуктивное образование кости. СЭМ: через 6 месяцев после имплантации отмечается образование костной ткани на поверхности TiUnite. Кость удалили, чтобы обнажился титан. Наблюдается внедрение кости в поры поверхности
P.S. Биомеханическая стимуляция кости и правильное распределение окклюзионной нагрузки на имплантат ведут к ремоделированию костной ткани и формированию слоя пластинчатой кости по всей внутрикостной поверхности имплантата. Прилегающая к имплантату костная ткань подвергается морфологической адаптации к механической нагрузке. При этом сама кость включает в себя костномозговые пространства, содержащие остеобласты, остеокласты, мезенхимальные стволовые клетки, кровеносные и лимфатические сосуды. Ремоделирование кости происходит на расстоянии до 1 мм от поверхности имплантата (см. рис. 5).
б) Форма имплантатов и заживление костной ткани. Как известно, первичная стабильность имплантата обеспечивается только его механическим прикреплением к костным стенкам ложа при отсутствии биологической связи.83 Обычно хирург определяет степень первичной стабильности по усилию, необходимому для установки имплантата в требуемое положение. Такое усилие выражается в Н*см и характеризует силу трения между поверхностью имплантата и стенками костного ложа. Кость обладает определенной эластичностью, поэтому стабильность имплантата зависит от выраженности костной деформации. В действительности стабильность снижается при трансформации микропереломов в макропереломы, которые сопровождаются повреждением кровеносных сосудов и ишемией костной ткани, что может приводить к ее некрозу. Нередко все это наблюдается при избыточном диаметре резьбы имплантата и диаметре костного ложа.
Coelho и Jimbo изучили взаимосвязь между конфигурацией имплантата и размером костного ложа. По мнению этих авторов, не следует стремиться к очень высокой первичной стабильности, поскольку это чревато избыточной деформацией, которая ведет к снижению биомеханической стабильности. Кроме того, некоторые варианты резьбы имплантата могут вызывать чрезмерную компрессию костной ткани.
В частности, в эксперименте на нижней челюсти собак устанавливали имплантаты с V-образной конфигурацией резьбы при формировании костного ложа одинакового с имплантатом диаметра. В таких случаях через 2 недели после имплантации гистологически отмечалось плотное непрерывное прилегание кости к поверхности имплантата, что соответствует высокой первичной стабильности (рис. 7а). Однако концентрация стрессовой нагрузки по кромке резьбы приводила к микропереломам и ремоделированию кости, которое определялось через 4 недели после установки (рис. 7b). В период 2-4 недель после имплантации наблюдалось уменьшение первичной стабильности в результате резорбции костной ткани, а последующее образование кости и ее прикрепление к имплантату обеспечивали его вторичную стабильность. Описанный процесс Coelho и Jimbo назвали пограничным ремоделированием, а окружающая имплантаты кость приобретала пластинчатую структуру с несколькими маленькими костномозговыми пространствами.
Рисунок 7. Оптические микрофотографии имплантатов с V-образной резьбой (исследование на собаках):
(а) Через 2 недели после имплантации отмечается почти непрерывный контакт между костью и поверхностью имплантата, что обеспечивает его первичную стабильность. Красные стрелки указывают на микротрещины в области концентрации нагрузки на кость; синие стрелки указывают на участки начального ремоделирования в результате компрессионного некроза.
(b) Через 4 недели наблюдается выраженное ремоделирование: пунктирная линия отграничивает зону костной резорбции вблизи имплантата; зеленая стрелка указывает на ремоделирование в области микротрещины
При установке имплантата в костное ложе, диаметр которого соответствует кромкам резьбы имплантата, между ее витками остаются свободные пространства, где происходит так называемое внутримембранное заживление (оссификация в соединительнотканной мембране). В этих пространствах, или камерах заживления, образуется кровяной сгусток, который не обеспечивает первичную стабильность, но очень важен для вторичной. Образование костной ткани начинается непосредственно на поверхности имплантата без предварительной резорбции прилегающей кости. Описанная модель не предполагает высокую первичную стабильность, а фиксация имплантата обеспечивается его апикальной частью. При этом кровяной сгусток между витками резьбы остается защищенным от внешнего воздействия, что способствует остеогенезу.
Эксперимент на собаках показал, что первичная стабильность во многом зависит от разницы между диаметрами костного ложа и имплантата. Чем меньше давление имплантата на кость, тем ниже риск ее резорбции. Кроме того, нормальный остеогенез с замещением кровяного сгустка образованной костной тканью повышает вторичную стабильность имплантата.
В настоящее время считается предпочтительным создавать условия для комбинированного заживления, чтобы добиться достаточной первичной стабильности имплантатов и быстрого достижения вторичной. Такой подход обеспечивает сочетание пластинчатой кости, которая образуется в результате пограничного ремоделирования, и оссификации соединительной ткани. Тем не менее нужно отметить, что сегодня имплантатов, обладающих такой конфигурацией, немного, а долгосрочных научных исследований, посвященных изучению комбинированного остеогенеза, пока нет.
P.S. Davies выделил три фактора успеха немедленного протезирования на имплантатах:
1) достаточная первичная стабильность, т.е. отсутствие микроподвижности имплантата сразу после его установки;
2) достаточная вторичная (биологическая) стабильность, которая обеспечивается остеогенезом вокруг имплантата;
3) минимизация или предотвращение костной резорбции с помощью профилактики аномальной нагрузки на имплантат в ходе заживления.
