Применение стволовых клеток в эндодонтическом лечении (регенеративной эндодонтии)
Применение принципов тканевой инженерии для разработки регенеративных эндодонтических процедур требует исследования правильной пространственной сборки различных стволовых клеток, факторов роста/морфогенов и биологических матриц для формирования функционального дентино-пульпарного комплекса. В статьях на сайте каждый из этих важных компонентов будет рассмотрен в отдельности.
Стволовые клетки определяются как отдельная субпопуляция недифференцированных клеток с потенциалом самообновления и дифференцировки. Они могут быть классифицированы как плюрипотентные или мульти-потентные клетки. Плюрипотентные стволовые клетки обладают способностью к дифференцировке и принадлежат к трем зародышевым слоям. Эмбриональные стволовые клетки являются лучшим примером плюрипотентных клеток.
Существует значимый исследовательский курс по эмбриональным стволовым клеткам, но этические, юридические и медицинские (проблемы отбраковки тканей) проблемы могут сделать эти типы клеток непригодными для клинических применений. Истинные плюрипотентные стволовые клетки могут быть найдены только у развивающегося эмбриона, и сбор данных клеток требует уничтожения самого эмбриона, что из-за юридических и этических соображений не может быть применено на практике.
Yamanka и соавт. сообщили о том, что соматические клетки можно трансформировать в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Использование iPSCs не имеет таких же юридических и этических проблем, как использование эмбриональных стволовых клеток, но iPSCs свойственны неконтролируемая пролиферация и дифференциация эмбриональных стволовых клеток. Эти клетки, как правило, формируют тератомы после имплантации в организм реципиента, что является истинным свидетельством их высокой способности к пролиферации и дифференцировке, но и делает их непригодными для общей клинической практики. С другой стороны, у всех MSC взрослых людей более ограничена способность к дифференцировке, они способны лишь формировать ткани мезенхимного происхождения, поэтому классифицируются как мультипотентные.
Эти клетки могут быть обнаружены внутри тканей в нишах для стволовых клеток.
Мезенхимальные ткани (например, кости, пульпа, периодонтальная связка и т.д.), по-видимому, имеют обогащенную популяцию взрослых стволовых клеток. Эти клетки были впервые обнаружены в костном мозге несколько десятилетий назад, характеризовались как самообновляющиеся и пластические адгезивные клетки и образовали клеточные колонии с признаками фибробластов. Первоначально они назывались стромальными стволовыми клетками, но позже получили широко распространенное название MSC. Большинством стволовых клеток, обнаруженных в орофациальной области, являются MSCs.
Различные популяции взрослых стволовых клеток обнаружены в тканях полости рта. К ним относятся стволовые клетки апикального сосочка (Stem cells of the apical papilla, SCAP), ПА воспалительные клетки-предшественники (Inflammatory periapical progenitor cells, iPAPC), стволовые клетки зубного фолликула (Dental follicle stem cells, DFSC), стволовые клетки пульпы (Dental pulp stem cells, DPSC), стволовые клетки периодонтальной связки (Periodontal ligament stem cells, PDLSC), стволовые клетки костного мозга (Bone marrow stem cells, BMSC), клетки-предшественники зубных зачатков (Tooth germ progenitor cells, TGPC), стволовые клетки слюнных желез (Salivary gland stem cells, SGSCs), стволовые клетки человеческих выпавших молочных зубов (Stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED), стволовые клетки эпителия полости рта (Oral epithelial stem cells, OESC), MSC, полученные из десны (Gingival-derived mesenchymal stem cells, GMSC), и стволовые клетки, полученные из надкостницы (Periosteal derived stem cells, PSC) (рис. 1).
Рисунок 1. Схема с изображением потенциальных источников постнатальных стволовых клеток в полости рта. Типы клеток: клетки-предшественники зубных зачатков (TGPCs); стволовые клетки зубного фолликула (DFSCs); стволовые клетки слюнных желез (SGSCs); стволовые клетки апикального сосочка (SCAP); стволовые клетки пульпы (DPSCs); периапикальные воспалительные клетки-предшественники (iPAPCs); стволовые клетки выпавших молочных зубов человека (SHED); стволовые клетки периодонтальной связки (PDLSCs), стволовые клетки костного мозга (BMSCs) и, как показано на масштабированном рисунке, стволовые клетки эпителия полости рта (OESCs); мезенхимальные стволовые клетки, полученные из десны (GMSCs); а также стволовые клетки, полученные из надкостницы (PSCs).
Несмотря на то что стволовые клетки были обнаружены в большинстве тканей полости рта, наиболее вероятно, что стволовые клетки, участвующие в процессах восстановительной эндодонтии, локализованы вокруг ПА-области. К ним относятся SCAP, PDLSC, BMSC, iPAPC и DPSC (при наличии витальной пульпы в апексе).
Апикальный сосочек и стволовые клетки, полученные из него (SCAP), впервые были описаны в 2006 г.. Апикальный сосочек (рис. 2) представляет собой плотный резервуар недифференцированных MSC с большими пролиферативным потенциалом и способностью к одонтогенной дифференцировке.
Рисунок 2. A-C. Рассечение постоянного зуба с не полностью сформированным корнем, с указанием размера апикального сосочка. Следует отметить, что апикальный сосочек, вероятно, будет разорван во время вызываемого кровотечения при реваскуляризации, и, следовательно, клетки, включая стволовые клетки апикального сосочка, скорее всего, будут перемещены в корневой канал. Стрелка на рис. В обозначает пересечение апикального сосочка и пульпы.
Важно отметить, что SCAP находятся под контролем Гертвиговского эпитеалиального влагалища посредством серии сложных эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, которые определяют развитие и форму корня. Кроме того, близкое расположение апикального сосочка к верхушке зуба в сочетании с пространством корневого канала позволяет провести восстановительную эндодонтическую терапию. iPAPCs представляют собой еще один важный потенциальный источник стволовых клеток для восстановительной эндодонтии у зубов с выраженным апикальным периодонтитом.
Наконец, периодонтальная связка и стволовые клетки костного мозга следует также рассматривать как источники стволовых клеток для регенеративных процедур, так как механическое воздействие на апикальную ткань (вызов кровотечения) также способно вызвать высвобождение этих клеток, хотя их количество, как полагают, значительно меньше, чем количество SCAP и iPAPC. В 2011 г. было проведено исследование для оценки наличия MSC после вызова повторного кровотечения при восстановительных процедурах. Было обнаружено, что при регенеративных процедурах происходит поступление большого количества MSC в корневые каналы, что приводит к увеличению более чем в 700 раз экспрессии маркеров MSC (рис. 3).
Рисунок 3. Вызов кровотечения при эндодонтических восстановительных процедурах в зубах с не полностью сформированными корнями и открытыми верхушками приводит к значительному увеличению экспрессии маркеров недифференцированных MSC в корневом канале. Во время второго посещения восстановительных процедур были взяты кровь из системного кровотока, солевой раствор и образцы внутриканальной крови. Была выполнена полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени с использованием РНК, выделенной из каждого образца в качестве шаблона, с проверенными специфическими праймерами для целевых генов и 18S рибосомальной РНК эндогенного контроля. Экспрессия MSC CD73 и CD105 была активирована после стадии вызова кровотечения при восстановительных процедурах. Данные были нормализованы к уровням 18S конститутивных генов, представлены как увеличение стандартного отклонения по отношению к уровням крови системного кровотока для каждого гена и проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа с поправками по методу Бонферрони (n=8; р<0,05; р<0,01; не статистически значимый).
Кроме того, клетки можно собрать из клинических образцов и исследовать под конфокальным микроскопом (рис. 4). Это явилось первым доказательством того, что восстановительные эндодонтические процедуры — терапия на основе стволовых клеток. Однако в исследовании не оценивали MSC, обнаруженные при восстановительных эндодонтических процедурах в области апикального сосочка. Предполагалось, что эти клетки были SCAP, так как на этапе вызова кровотечения апикальный сосочек был разорван. Однако данные MSC представляют собой гетерогенную популяцию клеток, которая может исходить из любой из перирадикулярных тканей после вызова кровотечения в системе корневых каналов.
Рисунок 4. Мезенхимальные стволовые клетки переместили в корневой канал во время восстановительных процедур в зубы с не полностью сформированными корнями и открытыми верхушками. Клетки, собранные из образцов внутриканальной крови после вызова кровотечения или из крови системного кровотока, окрасили с применением антител против CD105, CD73 или Stro-1 и исследовали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа. В клетках внутриканальных образцов крови, собранных после вызова кровотечения, определялась экспрессия маркера MSC (А) и CD105 (зеленые на картинке A), CD73 (зеленый на картинке B) и STRO-1 (зеленый на картинке C), в то время как ядра окрасились в синий цвет, поскольку смешались с TO-PRO-3.
Значительная концентрация MSC в корневых каналах, несмотря на наличие апикального периодонтита или абсцесса, указывает на высокую устойчивость данных клеток в очагах воспаления, которые характеризуются низким содержанием кислорода, низким уровнем pH и высокой концентрацией эндотоксинов и медиаторов воспаления. Действительно, обнаружение высоких концентраций маркеров иммунных клеток CD14 в этих клинических образцах указывает на то, что в апикальной области этих зубов присутствует хронический воспалительный экссудат. Таким образом, MSC, такие как SCAP, могут сохранять устойчивость в зубах с диагнозом «апикальный периодонтит», где обычно встречаются полимикробная флора, большое количество воспалительных медиаторов, иммунных клеток и, по-видимому, низкое содержание кислорода.
С точки зрения биологии, такая устойчивость, несмотря на сложные условия, может быть объяснена относительно низкой плотностью кровеносных сосудов в апикальном сосочке по сравнению с соседней пульпой зуба, тогда как зубной фолликул, окружающий апикальный сосочек, сильно васкуляризирован и может выступать в роли капиллярного слоя для подачи питательных веществ к SCAP. Так, апикальный сосочек оказался витальным, несмотря на полный некроз пульпы и апикальный периодонтит, на животной модели с эндодонтической инфекцией. Кроме того, было продемонстрировано, что среды с низким содержанием кислорода усиливают пролиферацию, устойчивость и ангиогенный потенциал стволовых клеток зуба. Интересно, что аналогичные усиливающие эффекты наблюдались, когда стенки зуба подвергались воздействию бактериальных побочных продуктов, таких как эндотоксин.
Таким образом, кажется, что SCAP и окружающие стволовые клетки адаптированы для выживания и поддержания их потенциала для дифференциации в неблагоприятных условиях, таких как апикальный периодонтит и апикальные абсцессы. Тем не менее стволовые клетки, доставленные в корневые каналы в процессе кровотечения из перирадикулярных тканей, вероятно, из различных апикальных источников или ниш.
Пульпу зуба можно рассматривать как ядро иннервированной и васкуляризированной рыхлой соединительной ткани, окруженное слоем одонтобластов. Основным типом клеток ядра является фибробласт. Вместе с кровеносными и лимфатическими сосудами и нейронами данная ткань внедряется во внеклеточный матрикс, состоящий из коллагена и других типов волокон.
DPSC располагаются на всем протяжении пульпы зуба, но, как известно, они накапливаются в периваскулярной области и богатой клетками зоне Хохла (Hohl), прилегающей к одонтобластическому слою. Таким образом, DPSC из данных двух областей считаются активными участниками процесса репаративного дентиногенеза.
Стволовые клетки пульпы зуба доставляются к месту повреждения по градиенту хемотаксических агентов, высвобождаемых постоянно присутствующими иммунными клетками и из разрушенного дентина. Репаративный дентин, образованный этими клетками, отличается от первичного, вторичного и реактивного (защитного) дентина, который был утерян. Его часто называют «остеодентином», когда обнаруживают дезорганизованную ткань без трубочек, но с клеточными включениями. Данный процесс клеточного замещения усиливают применением биологически активных материалов (например, МТА и Биодентин). Применение данных материалов увеличивает основной минерализирующий потенциал пульпы зуба как при прямом, так и непрямом ее покрытии.
Тем не менее для процесса образования третичного дентина необходимо наличие витальной пульпы и установленной этиологии (например, кариеса или травмы). Данный процесс нарушается при повреждении пульпы, что приводит к ее колликвационному некрозу. Регенерация в таком случае возможна только при наличии или помещении аутологичных стволовых клеток в канал после адекватно проведенной дезинфекции.
Одонтобласты — одни из высокоспециализированных клеток дентино-пульпарного комплекса, обладающие дентиногенными, иммуногенными и, возможно, сенсорными функциями. Одонтобласты в интактном дентино-пульпарном комплексе легко идентифицируются на основе их расположения и морфологической характеристики (т.е. цилиндрические клетки с отростками, уходящими в дентинные канальцы). Однако гораздо сложнее идентифицировать и охарактеризовать одонтобластоподобные клетки, главным образом потому, что для них не характерна первичная морфология одонтобласта и уникальные маркеры, которые могут быть использованы для идентификации. Так, многие маркеры, используемые для идентификации одонтобластоподобных клеток, также экспрессируются в других типах минерализирующих клеток, например в остеобластах. Одонтобластоподобные клетки и остеобласты схожи в образовании минерализованных конкреций и в экспрессии нескольких белков, например, дентинного сиалопротеина (DSP), но уровень DSP почти в 400 раз выше в одонтобластах, чем в остеобластах.
Определение только одного или двух признаков клетки может быть недостаточно для уточнения того, является ли клетка истинным одонтобластом. Даже среди одонтобластов фенотип клеток различен: расположенные в апикальной области имеют плоскую форму, а в корональной области — цилиндрическую. Важно отметить, что в молекулярных исследованиях выявили многие гены, избирательно экспрессируемые в одонтобластах. Наконец, было показано, что белок промежуточной нити, называемый нестин, предпочтительно экспрессируется в одонтобластах или одонтобластоподобных клетках на этапе активной секреторной функции. Экспрессия нестина может использоваться в сочетании с другими маркерами для более совершенной идентификации одонтобластоподобных клеток. Полагают, что эти знания помогут будущим исследованиям, изучающим условия, необходимые для дифференцировки мезенхимальных клеток с множественным происхождением в одонтобластоподобные клетки. Таким образом, окончательная клеточная идентификация зависит как от морфологии клетки, так и от оценки экспрессии множественных генов.
Кроме DPSCs в одонтобластоподобные клетки способны дифференцироваться, минимум 5 типов клеток: SHED, SCAP, iPAPCs, DFPC, BMMSC.
В одном исследовании было подтверждено, что чрезмерное вмешательство в перирадикулярные ткани с последующим внутриканальным кровотечением приводит к устойчивому притоку стволовых клеток с мезенхимальными маркерами в зубах с полностью сформированными корнями, подобно тому, как это происходит в зубах с не сформированными корнями. Так, MSC апикальной области могут поступать в каналы зубов как с несформированными, так и со сформированными корнями. Однако с возрастом потенциал пролиферации и дифференциации MSC снижается. Дальнейшие исследования необходимы для выяснения возрастных ограничений для использования аутологичных производных стволовых клеток зуба. Тем не менее эти данные свидетельствуют о том, что регенеративные процедуры могут применяться в зубах с полностью сформированными корнями у взрослых. В доказательственном отчете устранение апикального периодонтита, сопровождаемого сужением пространства канала и закрытием апекса, было зарегистрировано в двух зубах с полностью сформированными корнями у взрослых пациентов, при проведении восстановительных эндодонтических процедур.
Требуется больше исследований и разработок для усовершенствования восстановительных процедур для зубов с не полностью сформированными корнями, которые в дальнейшем смогут быть применены в зубах с полностью сформированными корнями.
