P.S. Мероприятия и подходы, изложенные в данной статье на сайте, в РФ регулируются Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 28.01.2021 № 4 «Об утверждении санитарных правил и норм СанПиН 3.3686-21 “Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней”» и некоторыми КР.
Лабораторные доказательства диагноза инфекционного заболевания м.б. основаны на одном или нескольких следующих факторах: прямое исследование образцов с использованием микроскопических методов или методов обнаружения АГн, выделение микроорганизмов в культуре, серологическое тестирование, паттерны экспрессии генов хозяина или молекулярное обнаружение микроорганизма, детерминанта устойчивости или фактор вирулентности.
Некоторые дополнительные функции лаборатории клинической микробиологии включают выполнение тестов на чувствительность к АБ и поддержку профилактики госпитальных инфекций путем обнаружения и верификации патогенов, связанных с в/больничными инфекциями.
а) Забор образцов. Успех диагностического микробиологического анализа, т.е. обнаружение патогена, если он присутствует, напрямую связан с методами забора образцов.
Как правило, это означает взятие образца правильного типа для рассматриваемого заболевания или состояния и его своевременную транспортировку в лабораторию для анализа. В некоторых случаях мазок — неоптимальный образец. Тампон может вместить очень небольшое количество образца (100 мкл), а при использовании традиционного тампона только небольшая часть организмов, абсорбированных им, попадет в культуру. Флокированные тампоны в сочетании с транспортной средой улучшают выделение микроорганизма.
Однако, по возможности, в лабораторию для анализа следует отправить саму исследуемую жидкость или ткань. При подозрении на анаэробную инфекцию образец следует транспортировать в подходящей среде для сохранения жизнеспособности анаэробных бактерий. Для восстановления некоторых типов организмов, таких как вирусы и Neisseria gonorrhoeae, могут потребоваться специальные транспортные среды. Особенности забора крови для культивирования рассматриваются в разделе о культуре крови.
б) Лабораторная диагностика бактериальных и грибковых инфекций. Хотя объем и доступность молекулярных методов обнаружения бактериальных и грибковых патогенов быстро увеличиваются, диагностика многих этих инфекций в рутинной практике зависит от микроскопического обнаружения организмов или их культивирования на питательной среде.
1. Микроскопия. Окрашивание по Граму — чрезвычайно ценный диагностический метод, позволяющий быстро и недорого получить информацию об отсутствии или наличии воспалительных кл. и организмов в клинических образцах. Для некоторых типов образцов наличие воспалительных и эпителиальных кл. используется для оценки пригодности образца для культивирования. Напр., наличие >10 эпителиальных кл. в п.з. в образце мокроты при слабом увеличении с большой вероятностью указывает на то, что он загрязнен оральным секретом. Кроме того, предварительная оценка этиологического агента м.б. проведена на основе морфологии (напр., кокки против палочек) и окрашивания (напр., грамположительные изоляты имеют фиолетовый цвет; грамотрицательные — красный) микроорганизмов.
Однако отрицательный результат окрашивания по Граму не исключает контаминации, поскольку для обнаружения этим методом требуется 104-104 микроорганизмов в 1 мл образца.
В дополнение к окраске по Граму в микробиологии используется множество др. красителей как для обнаружения организмов, так и для определения их идентичности (см. табл. 1).
2. Изоляция и идентификация. Подход к выделению микроорганизмов в клиническом образце будет варьировать в зависимости от участка тела и предполагаемого патогена. Для сред, которые обычно стерильны, таких как СМЖ, используют богатые питательными веществами среды, такие как агар с овечьей кровью и шоколадный агар, чтобы помочь в восстановлении прихотливых патогенов. Напротив, образцы кала содержат большое количество комменсальных бактерий, поэтому для выделения патогенов необходимо использовать селективные и дифференциальные среды. Селективная среда будет подавлять рост некоторых организмов, чтобы помочь изолировать настораживающие патогены.
Дифференциальная среда зависит от характеристик роста или ассимиляции углеводов, позволяющих дифференцировать микроорганизмы. Агар МакКонки поддерживает рост грамотрицательных палочек при подавлении грамположительных организмов, а изменение цвета среды с прозрачного на розовый отличает ферментирующие лактозу микроорганизмы от др. грамотрицательных палочек.
Для выращивания микотической флоры в клинических образцах используются специальные среды, такие как декстрозный агар Сабуро и агар с ингибитором плесени. Многие патогены, включая Bartonella, Bordetella pertussis, Legionella, Mycoplasma, некоторые Vibrio spp. и определенные микотические патогены, такие как Malassezia furfur, требуют специальных питательных сред или условий инкубации. При подозрении на эти патогены рекомендуется проконсультироваться в лаборатории. После того как микроорганизм выращен в культуре, проводится дополнительное тестирование для идентификации изолята. Подтверждение микробной идентичности обычно выполняется с использованием тестов, основанных на фенотипических свойствах изолята, напр. коагулазная активность, паттерны ассимиляции углеводов, продукция индола и подвижность.
Однако фенотипические методы не могут идентифицировать все микроорганизмы на уровне видов, кроме того, требуется определенное время для их инкубации, поэтому в некоторых случаях возникает необходимость в идентификации микроорганизмов с помощью молекулярно-генетического анализа. Для бактерий это обычно основано на анализе последовательности бактериального гена 16S рибосомной РНК. Этот ген представляет собой «молекулярный хронометр», который очень консервативен внутри вида, но значительно варьирует у разных видов, являясь отличным маркером для идентификации микроорганизмов.
Матричная лазерная десорбционно-ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS; англ. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry) — это быстрый и точный метод, основанный на создании белкового отпечатка организма и сравнении этого отпечатка с библиотекой известных организмов для идентификации. Этот метод может идентифицировать бактерии или дрожжи, которые были восстановлены в культуре в течение нескольких минут, а затраты на расходные материалы для этих анализов минимальны. Однако этому методу в настоящее время не хватает возможности разделения полимикробных образцов, а биомасса, необходимая для успешного анализа MALDI-TOF MS, обычно исключает возможность анализа непосредственно из клинических образцов.
- Культура крови. Выявление микробов в образцах культур крови пациентов с сепсисом — одна из важнейших функций лаборатории клинической микробиологии. Большинство культур крови включают богатый питательными веществами бульон, способствующий росту бактерий или дрожжей. Посев крови осуществляется с использованием аэробного и анаэробного флаконов, называемых набором для культуры крови, хотя у детей, особенно новорожденных, обычно используется только аэробный флакон. Некоторые среды для культивирования крови содержат ионообменные смолы или др. агенты, способствующие нейтрализации АБ, которые могут присутствовать в крови пациентов.
Затем флаконы для культур крови помещаются в автоматический инкубатор, который будет контролировать их через регулярные промежутки времени на наличие признаков роста. Как только прибор обнаруживает признаки роста микробов, лаборатория получает сигнал тревоги. Примерно 80% посевов крови, которые в конечном итоге будут положительными, идентифицируются в течение первых 24 ч инкубации. Часть бульона из флакона с культурой крови, которая показала положительный результат, окрашивают по Граму и затем инокулируют в подходящую питательную среду, чтобы можно было выделить и идентифицировать организм. На точность результатов посева крови могут влиять многочисленные преаналитические факторы. Для облегчения точной интерпретации при положительном посеве крови следует, по возможности, взять как минимум 2 культуры крови из разных локализаций.
Рост микроорганизма, который является частью нормальной кожной флоры из одного посева крови, вызывает опасения, что изолят возник в результате контаминации культуры.
Чтобы максимально увеличить вероятность выявления возбудителя сепсиса, необходимо получить до 4 культур крови в течение 24 ч. Перед забором крови необходима надлежащая антисептика кожи. Для этой цели часто используется хлоргексидин, а также этанол. Если забор крови осуществляется через перманентный катетер, надлежащая антисептика перед забором также важна. Не следует производить забор образцов крови из ПВК/ЦВК вместо периферических вен, поскольку трудно определить значимость коагулазонегативных стафилококков, кожной флоры или микроорганизмов окружающей среды, выделенных из этих культур. Разница во времени до положительного результата в >2 ч между парными культурами крови, взятыми одновременно из катетера и периферической вены, считается показателем катетерной инфекции кровотока.
Объем собранной крови для посева также является важным фактором в восстановлении патогенов системного кровотока, особенно с учетом того, что количество микроорганизмов на миллилитр крови при сепсисе м.б. низким (<10 КОЕ/мл). Оптимальное количество крови для взятия у педиатрического пациента зависит от МТ ребенка. Институт клинических и лабораторных стандартов (CLSI; англ. Clinical and Laboratory Standards Institute) и Cumitech разработали рекомендации по безопасному забору крови у детей, имеющих различную МТ. Для детей 3-12 кг: 3-5 мл; 12-36 кг: 5-10 мл; 36-50 кг: 10-15 мл и >50 кг: 20 мл.
Ряд быстрых диагностических тестов можно выполнить непосредственно на бульоне с положительной культурой крови для выявления патогенов, часто связанных с бактериемией и некоторыми детерминантами устойчивости к АБ. Большинство этих быстрых диагностических анализов основаны на МАНК. Напр., система Verigene может идентифицировать виды стафилококков, стрептококков и энтерококков, а также генетические детерминанты АБ-резистентности — тесА и vanAgenes в бульоне с положительной культурой крови ~за 2 ч с использованием панели культуры грамположительной крови.
После подготовки образца для концентрирования микроорганизмов и удаления остаточного бульона и крови из положительного образца культуры крови м.б. использован метод MALDI-TOF MS. Эти анализы могут помочь сократить интервал между положительным посевом крови и окончательной идентификацией организма с целью ранней оптимизации АБТ.
Обнаружение микобактерий и некоторых мицелиальных грибов (напр., Histoplasma capsulatum) в кровотоке максимально повышается с использованием методов лизиса-центрифугирования, таких как система Isolator (Wampole, Cranbury, NJ).
- Культура спинномозговой жидкости. СМЖ следует быстро доставить в лабораторию, а затем подвергнуть цитоцентрифугированию, чтобы сконцентрировать микроорганизмы для микроскопического исследования. СМЖ обычно культивируют на кровяном и шоколадном агаре, которые поддерживают рост обычных патогенов, вызывающих менингит. Если есть подозрение на туберкулез, следует отдельно сделать посев на микобактерии. Культивирование больших объемов СМЖ (>10 мл) значительно Т высеваемость микобактерий.
Исторически сложилось так, что тесты для быстрого обнаружения АГн таких бактериальных патогенов, как Hib и Streptococcus pneumoniae, использовались с целью выявления микроорганизмов в СМЖ без необходимости ее посева. Этим методам не хватает чувствительности, а в некоторых случаях специфичности. Окраска по Граму так же чувствительна, как и тесты на бактериальные АГн для обнаружения микроорганизмов в СМЖ. Напротив, тест на криптококковый АГн м.б. полезен при подозрении на криптококковый менингит. Исторически для обнаружения Cryptococcus в СМЖ использовались препараты индийских чернил, но этот метод менее чувствителен по сравнению с анализом обнаружения АГн.
В эпоху вакцинации эпидемиология инфекционного менингита быстро изменяется, и в настоящее время острый бактериальный менингит в Северной Америке является относительно нечастым явлением. Многие инфекции СМЖ связаны с шунтированием или др. вмешательством, и пропионибактерии и коагулазонегативные стафилококки являются микроорганизмами, наиболее часто выделяемыми при шунт-ассоциированных инфекциях. В лаборатории должны быть среды, способствующие росту пропионибактерий в образцах СМЖ, полученных от нейрохирургических пациентов.
- Посев мочи. Мочу для посева (включая подсчет числа колоний) можно получить, взяв образцы с чистой мочой из средней порции, при катетеризации или при надлобковой пункции. Образцы мочи, собранные путем размещения мочеприемника в промежности, неприемлемы для посева, поскольку они часто бывают загрязненными. Быстрая транспортировка неконсервированной мочи в лабораторию (<2 ч) является обязательной, а задержка с транспортировкой или посевом образцов делает подсчет колоний малоинформативным.
Если неизбежна задержка с доставкой образца, можно использовать устройства для охлаждения или транспортировки мочи с консервантом борной кислотой. Конкретное количество колоний, используемое для определения значимого роста в посеве мочи, несколько противоречиво и варьирует в зависимости от лаборатории.
Моча, полученная с помощью надлобковой пункции, обычно стерильна, и поэтому любой рост организмов обычно считается значимым. Моча, собранная путем катетеризации, может отражать инфекционный процесс, если в ней содержится >103-104 микробных тел/мл. Как правило, чистая моча, полученная естественным путем, считается патологически измененной, если в ней присутствует >104-105 микробных тел/мл, хотя интерпретация посева м.б. разной в зависимости от возраста пациента и клинических условий.
- Генитальная культура. Neisseria gonorrhoeae — нестойкий организм, поэтому для его эффективной идентификации необходимы сбор и транспортировка в специальной среде. Для ускорения извлечения N. gonorrhoeae в клинических образцах, таких как генитальные, аноректальные и глоточные мазки следует использовать селективный агар, такой как модифицированная среда Тайера-Мартина. Устойчивость к АБ у N. gonorrhoeae возрастает и представляется CDC как неотложная угроза, хотя немногие клинические лаборатории имеют возможность проводить тесты на чувствительность к АБ для этого организма. У педиатрических пациентов идентификация микроорганизма, подобного N. Gonorrhoeae, должна быть подтверждена двумя независимыми методами.
Образцы для культуры Chlamydia trachomatis получают с помощью уретральных тампонов с ватным наконечником и алюминиевым стержнем. Эндоцервикальные образцы следует собирать с помощью тампонов с алюминиевыми или пластиковыми стержнями, энергично протирая тампоном стенку эндоцервикального канала, чтобы получить как можно больше клеточного материала. С. trachomatis является облигатным в/клеточным организмом и культивируется путем инокуляции в системы культивирования кл. с последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием моноклональными АТл к микроорганизму. Методы, не связанные с культивированием, такие как МАНК, широко используются и более рентабельны, чем культивирование.
Хотя ТАНК для N. gonorrhoeae и С. trachomatis не одобрены FDA для использования у детей, эти тесты часто используются в этой популяции для обнаружения организмов в образцах мочи, эндоцервикальных мазках из влагалища и полового члена. ТАНК демонстрируют более высокую чувствительность по сравнению с методами культивирования. Некоторые лаборатории используют подход к подтверждению всех ТАНК-положительных образцов с помощью альтернативного ТАНК, который обнаруживает альтернативную генетическую мишень.
- Культуры из ротоглотки и респираторного тракта. Стрептококковый фарингит и тонзиллит — частые диагнозы у детей. С целью получения образца для обнаружения стрептококка группы A (Streptococcus pyogenes) осуществляется забор мазка из области миндалин и задней стенки глотки. При подозрении на фарингит, вызванный стрептококками группы А, часто используются быстрые тесты обнаружения АГн или нуклеиновых кислот. Отрицательные экспресс-тесты на АГн должны быть подтверждены с использованием методов посева.
Быстрые ТАНК для обнаружения стрептококков группы А также используются все чаще. Эти исследования обладают повышенной чувствительностью, но клинический опыт с ними все еще ограничен, и пока нет рекомендаций относительно необходимости резервного посева. Большинство лабораторий исследуют посевы из ротоглотки исключительно на наличие стрептококков группы А. Однако варианты крупных колоний стрептококков групп С и G (Streptococcus dysgalactiae) также были связаны с развитием фарингита, но не с теми постинфекционными последствиями, которые ассоциированы со стрептококком группы А. Лабораторные методы выявления и регистрации стрептококков групп С и G разнообразны и вызывают разногласия.
Помимо выявления патогенных стрептококков, клиническая лаборатория может определить наличие дифтерии, гонококкового фарингита или инфекции, вызванной глоточными штаммами Arcanobacterium haemolyticum. При подозрении на какой-либо из этих патогенов следует уведомить лабораторию, чтобы гарантировать использование соответствующих методов для выявления этих организмов.
Культуры на Bordetella pertussis можно получить путем аспирации или взятия мазка из носоглотки с помощью тампона из дакрона или альгината кальция. Аспират или мазок инокулируют на специальные среды с кровью из древесного угля (Regan-Lowe) или Bordet-Gengou, хотя в настоящее время для обнаружения В. pertussis в этих образцах все чаще используют молекулярно-генетические методы.
Причину заболевания нижних ДП у детей часто сложно подтвердить микробиологически вследствие проблемы с получением адекватных образцов мокроты. Для оценки адекватности забора образцов мокроты должно быть выполнено окрашивание мазков образцов по Граму. Образцы с большим количеством эпителиальных кл. (>10 в п.з. с большим увеличением) или с небольшим количеством нейтрофилов не подходят для культивирования, поскольку отсутствует корреляция между флорой ВДП и организмами, вызывающими заболевания нижних ДП. У пациентов с муковисцидозом следует использовать специальные средства для обнаружения патогенов, важных для муковисцидоза, таких как Burkholderia cepaciacomplex.
Эндотрахеальный аспират интубированных пациентов м.б. полезен, если при окраске по Граму выявляется большое количество нейтрофилов и бактерий, хотя патогены, выделенные из таких образцов, могут отражать только загрязнение из эндотрахеальной трубки или ВДП. Количественные посевы жидкости бронхоальвеолярного лаважа м.б. ценными для ДД инфекции ВДП и заболеваний нижних ДП.
Если есть подозрение на инфекцию Legionella, следует предупредить лабораторию, чтобы образец можно было инокулировать в специальные среды (напр., забуферен-ный агар с древесным углем и дрожжевым экстрактом) для облегчения выделения этого патогена. Тест на определение АГн легионелл в моче — это неинвазивный, чувствительный и специфичный метод быстрого выявления L. pneumophila серогруппы 1.
Диагноз туберкулеза легких у детей раннего возраста лучше всего ставить на основании посева раннего утреннего желудочного аспирата, полученного в течение 3 дней подряд. Индукция мокроты для получения образцов для посева микобактерий также является полезной у маленьких детей, но требует наличия квалифицированного персонала и средств защиты, чтобы предотвратить заражение медицинских работников. Культуры на Mycobacterium tuberculosis должны обрабатываться только в лабораториях, оборудованных соответствующими шкафами биологической безопасности и средствами защиты. ТАНК для обнаружения респираторных образцов М. tuberculosis (напр., анализ Cepheid Xpert МТБ) становятся широкодоступными и имеют очень высокую чувствительность при выполнении на образцах мокроты с положительным мазком.
- Детекция кишечных патогенов. У педиатрических пациентов с диареей может потребоваться посев кала на кишечные патогены. Свежий образец кала предпочтителен, но его не всегда можно получить. Если есть неизбежная задержка в транспортировке образцов, их следует поместить в подходящую транспортную среду, такую как Cary-Blair. Ректальные мазки для посева на кишечные патогены также являются приемлемыми образцами, если тампон имеет следы кала. Как правило, данные посевы следует проводить при взятии материала у амбулаторных пациентов или пациентов, которые были госпитализированы на срок <3 дней, поскольку в/больничное заражение кишечными патогенами в эти сроки крайне редко.
Образцы кала обычно помещают на несколько селективных и дифференциальных сред, чтобы уменьшить чрезмерный рост нормальной флоры и выявить патогенные организмы, если они присутствуют. Возможности определения конкретных патогенов варьируют в зависимости от лаборатории. Большинство лабораторий в Северной Америке регулярно проводят культивирование на Salmonella, Shigella, Campylobacter и Shiga-токсин-продуцирующие штаммы Escherichia coli. CDC рекомендует всем лабораториям использовать среду на основе агара для выделения Е. coli О157 в дополнение к анализу для обнаружения продукции токсина Shiga (напр., иммуноанализу для детекции токсина(ов) Shiga, МАНК для выявления stxl/stx2).
Практики, связанные с обычным культивированием Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, Edwardsiella, Aeromonas и Plesiomonas, будут различаться в зависимости от местной эпидемиологии, и лабораторию следует всегда уведомлять, если есть подозрение на один из этих патогенов.
Clostridium difficile является важной причиной диареи, связанной с приемом АБ. С. difficile долгое время считался в/больничным возбудителем у пожилых лиц, однако стали отмечаться случаи заболевания и в др. возрастных группах, а частота и тяжесть инфекции С. difficile у детей возрастают. Оптимальный метод обнаружения в образцах кала С. difficile является весьма спорным; в целом, однако, обнаружение токсина С. difficile в образцах кала имеет более высокую клиническую специфичность, чем методы обнаружения токсигенных культур или МАНК. Не рекомендуется проводить тестирование на С. difficile у детей <1 года вследствие высокой частоты колонизации в этой популяции пациентов.
Вирусы являются важной причиной гастроэнтерита у детей. Способы детекции вирусной инфекции различаются и могут включать выявление АГн (напр., для ротавируса или аденовируса 40/41) или МАНК (напр., для норовируса). В Северной Америке бремя паразитарного гастроэнтерита невелико. Полные микроскопические исследования на простейшие и яйца гельминтов в образцах кала, как правило, не дают результатов, в то же время выявление антигенов Cryptosporidium и Giardia, наиболее часто встречающихся простейших, являются чувствительным и экономичным методом обнаружения этих патогенов.
Мультиплексные ТАНК для одновременного обнаружения >12 кишечных патогенов, включая бактерии, вирусы и паразиты, одобрены FDA и доступны для клинического использования. Применение этих анализов в клинических лабораториях варьирует, и результаты этого тестирования нередко трудно интерпретировать, особенно когда в образце обнаружено несколько мишеней (напр., совместное обнаружение С. difficile и кишечного бактериального патогена у детей раннего возраста). Хотя эти тесты обещают ускорить обнаружение возбудителя диареи у детей, лаборатории и клиницисты все еще изучают, как лучше всего использовать данные методы.
- Культуры других жидкостей и тканей. Отделяемое из абсцессов, ран; плевральную, перитонеальную, суставную жидкость и др. типы отделяемого, имеющего гнойный характер, культивируют на твердом агаре и в некоторых случаях на бульонной среде. По возможности, жидкость и/или ткань, а не мазки с инфицированных участков, следует отправлять в лабораторию, тж. посев большего объема жидкости позволяет обнаруживать организмы, присутствующие в низкой концентрации.
Анаэробные организмы являются возбудителями большого числа абсцессов БП и др. локализаций. Эти образцы должны быть быстро собраны и доставлены в лабораторию в анаэробной транспортной среде.
Хотя золотистый стафилококк является наиболее частой причиной инфекций костей и суставов, Kingella kingae является важной причиной септического артрита у детей, особенно <4 лет. Обнаружение К. kingae максимально увеличивается за счет посева синовиальной жидкости в бульон для культур крови в дополнение к посеву на твердую среду. Ряд исследований предполагает, что молекулярно-генетический метод обнаружения К. kingae в образцах у молодых пациентов с подозрением на септический артрит м.б. наиболее чувствительным способом установления данного диагноза.
- Культуры для скрининга/эпидемиологического надзора. Клинические лаборатории могут проводить контрольные посевы на конкретные патогены либо для содействия инфекционному контролю в выявлении пациентов, которым требуется контактная изоляция, либо для расследования вспышки. Скрининговые культуры для выявления MRSA в передних отделах носовых ходов или устойчивых к ванкомицину энтерококков в образцах кала или ректальных мазках обычно могут выполняться у определенных групп пациентов. Кроме того, МО с устойчивыми к карбапенемам Enterobacteriaceae или высокой распространенностью энтеробактерий, продуцирующих β-лактамазы расширенного спектра (ESBL; англ. Extended-Spectrum Beta-Lactamases), могут проверять пациентов на носительство этих организмов.
Для этого часто используются хромогенные среды. Данные среды содержат запатентованные соединения для выбора устойчивых микроорганизмов и приводят к росту окрашенных колоний, что помогает идентифицировать интересующий микроб.
в) Тестирование на чувствительность к антимикробным препаратам. Тесты на чувствительность к АБ обычно проводятся на микроорганизмах, имеющих клиническое значение, для которых существуют стандарты и критерии интерпретации для тестирования на чувствительность. В Северной Америке большинство лабораторий используют коммерческие автоматизированные системы для тестирования чувствительности. Результатом работы этих систем является значение МИК и интерпретация этого значения как чувствительного, промежуточного или устойчивого.
Следующим наиболее распространенным методом является дисковая диффузия Кирби-Бауэра, при которой стандартизированный посевной материал организма высевается на чашку с агаром. Затем на поверхность агара помещают диски из фильтровальной бумаги, пропитанные АБ. После инкубации в течение ночи измеряется зона ингибирования роста бактерий вокруг каждого диска и сравнивается с национальными стандартами чувствительности или устойчивости.
Менее распространенным методом является тестирование бульона или разведения микробов.
Стандартная концентрация микроорганизма вводится в серийно разведенные концентрации АБ и определяется МИК в мкг/мл — самая низкая концентрация АБ, необходимая для подавления роста микроорганизма. Метод градиентной диффузии, такой как Е-тест, представляет собой гибрид дисковой диффузии и разбавления в бульоне и может использоваться для определения МИК отдельных АБ на чашке с агаром. В нем используется бумажная полоска, пропитанная известным постоянным градиентом концентрации АБ, который диффундирует по поверхности агара, подавляя рост микробов в эллиптической зоне. МИК считывается с напечатанной полосы в точке, в которой зона пересекает полосу. Основными преимуществами метода градиентной диффузии являются надежная интерпретация, воспроизводимость и применимость к организмам, которым требуются специальные среды или условия роста.
Помимо предоставления данных для проведения лечения отдельных пациентов, лаборатории используют совокупные данные тестирования чувствительности для создания отчетов об АБ-граммах для конкретных МО. Эти отчеты резюмируют тенденции восприимчивости для обычных организмов и могут использоваться для руководства эмпирической терапией до появления специфической восприимчивости по результатам тестирования.
Паттерны восприимчивости к АБ быстро меняются, поскольку у микробов появляются новые механизмы устойчивости. Рекомендации по стандартам эффективности тестов на чувствительность к АБ и их интерпретация регулярно обновляются такими группами, как CLSI и Европейский комитет по тестированию на чувствительность к АБ (EUCAST; англ. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing).
- Грибковые культуры. Для восстановления грибов, дрожжей и плесени в клинических образцах используются специальные питательные среды. Поскольку большинство грибов предпочитают пониженную температуру роста, а некоторые виды растут медленно, культуры грибов инкубируют при 30 °C (86 °F) в течение 4 нед. Все манипуляции с мицелиальными грибами должны производиться в шкафу биологической безопасности, чтобы избежать заражения лабораторного персонала и предотвращения контаминирования лаборатории.
Большинство дрожжей идентифицируются с использованием методов, аналогичных тем, которые используются для определения бактерий. Напротив, стандарт ухода за мицелиальными грибами не изменился почти за столетие. Лаборатория принимает во внимание скорость роста, цвет и характеристики колоний изолята, а затем готовит образец в лактофенол-аланиновом синем для микроскопической оценки.
Эти признаки в совокупности используются для идентификации изолята. В некоторых случаях секвенирование ДНК применяется для идентификации грибов, равно как и MALDI-TOF MS — для идентификации мицелиальных грибов. Используются также метод обнаружения АГн таких грибов, как Cryptococcus neoformans и Histoplasma capsulatum. Исследования для обнаружения галактоманнана — молекулы, обнаруженной в клеточной стенке Aspergillus (в дополнение к некоторым др. нитчатым грибам), — коммерчески доступны и все чаще используются для помощи в диагностике инвазивного аспергиллеза у ИКП.
г) Диагностика на месте оказания медицинской помощи. Некоторые анализы для обнаружения инфекций м.б. выполнены в медицинских офисах при условии, что объект сертифицирован как отвечающий соответствующим стандартам обеспечения качества, установленным Поправками по улучшению клинической лабораторной даигностики (CLIA; англ. clinical laboratory improvements amendments) 1988 г. К ним относятся процедуры, перечисленные в категории микроскопии, выполняемой поставщиком услуг, напр. такие как влажные препараты, препараты гидроксида калия, исследования на наличие остриц и ОАМ.
Многие педиатрические отделения проводят экспресс-тесты на обнаружение АГн и МАНК для выявления стрептококкового фарингита группы А и распространенных респираторных вирусов, таких как грипп, без сертификата CLIA.
Чувствительность тестирования в месте оказания МП зависит от техники сбора образцов, типа используемого набора и концентрации целевого патогена, присутствующего в образце. Кроме того, некоторые исследования по обнаружению АГн гриппа не обладают достаточной чувствительностью. Поставщики услуг, использующие диагностику на месте, должны ознакомиться с аналитическими характеристиками этих тестов и искать альтернативные методы тестирования при наличии клинических показаний.
Офисные лаборатории, имеющие лицензию на проведение испытаний, от которых отказались, ограничены в проведении этих испытаний и избегают необходимости проходить проверки и, в том числе, проверки квалификации, хотя они по-прежнему подчиняются требованиям сертификации CLIA, относящимся к этим испытаниям. Окрашивание по Граму, посев культур и выделение бактерий считаются тестами средней и высокой сложности в соответствии со спецификациями CLIA. Любая офисная лаборатория, проводящая окрашивание по Граму или посев, должна соответствовать тем же требованиям и проверкам в отношении обеспечения качества, проверки квалификации и требований к персоналу, что и полностью лицензированные микробиологические лаборатории.
д) Лабораторная детекция паразитарных инфекций. Большинство паразитов обнаруживается при микроскопическом исследовании клинических образцов. Plasmodium и Babesia можно обнаружить в окрашенных мазках крови, лейшманиоз — в окрашенных мазках костного мозга; яйца гельминтов, Entamoeba histolytica и Giardia lamblia м.б. обнаружены в окрашенных мазках кала (см. табл. 1). Серологические тесты важны для документирования воздействия определенных паразитов, таких как, напр., трихинелла, которые обычно не обнаруживаются в кале или крови, и поэтому их трудно продемонстрировать в исследуемом материале. Острицы — относительно распространенная паразитарная инвазия у детей. Лучшее время для получения образца с острицами — утро, до того, как пациент примет ванну или будет иметь стул. Кусок прозрачной ленты прижимается к перианальной области пациента и затем накладывается на прозрачное предметное стекло для последующего микроскопирования. Слайд исследуют на предмет обнаружения яиц остриц или самих гельминтов.
Образцы кала не должны быть загрязнены водой или мочой, потому что вода может содержать свободноживущие организмы, которых можно спутать с человеческими паразитами, а моча может уничтожить подвижные организмы.
Минеральное масло, барий и висмут мешают обнаружению паразитов, поэтому сбор образцов следует отложить на 7-10 дней после приема этих веществ. Поскольку лямблии и многие яйца гельминтов периодически выделяются с калом, рекомендуется брать минимум 3 образца в непоследовательные дни, чтобы исключить диагноз кишечного паразитоза.
Поскольку многие простейшие паразиты легко уничтожаются, следует использовать комплекты для сбора с соответствующими консервантами, если ожидается задержка между сбором образца и его транспортировкой в лабораторию. Обследование образцов кала на яйца гельминтов и простейшие включает в себя влажный мазок (для обнаружения подвижных организмов при получении свежего кала), концентрирование (для повышения количества исследуемых объектов) и постоянное окрашивание (напр., трихромом) для микроскопического исследования. Cryptosporidium, Cyclospora и Isospora обнаруживаются с помощью модифицированного кислотоустойчивого окрашивания, а микроспоридии — с помощью модификации окрашивания трихромом. Кроме того, Cyclospora и Isospora автофлуоресцируют при УФ-микроскопии. В случае подозрения на наличие этих паразитов следует предупредить лабораторию.
Выявление некоторых кишечных паразитов, особенно Giardia и Cryptosporidium, можно упростить с помощью тестов на обнаружение АГн (иммуноанализы или прямые тесты флуоресцентных АТл). Кроме того, Giardia и/или Cryptosporidium spp. м.б. мишенями, включенными в мультиплексные молекулярные панели для обнаружения патогенов, вызывающих диарею.
Амебный энцефалит, вызванный Acanthamoeba, Balamuthia или Naegleria — редкое, но тяжелое и быстро прогрессирующее заболевание. Для обнаружения этих организмов требуются специальные лабораторные красители и процедуры. В случае подозрения на инфекцию следует уведомить лабораторию.
Доступны экспресс-тесты для выявления антигенов Plasmodium spp. ЧС этих тестов различаются в зависимости от количества паразитов в образце и конкретного вида плазмодиев. В общем, эти тесты наиболее чувствительны для обнаружения Р. falciparum и наименее — для Р. malariae.
Они особенно полезны для лабораторий, в которых отсутствует персонал, обученный оценке «толстой капли» и тонких мазков на малярию или для быстрого получения предварительного результата в ожидании микроскопии. Все положительные и отрицательные экспресс-тесты на малярию должны быть подтверждены анализом мазка крови.
Trichomonas vaginalis — простейшие, передающиеся половым путем, которые также могут передаваться через домашние предметы. Инфицированные люди могут не иметь симптомов заболевания или иметь признаки воспаления и дискомфорта от легкой до тяжелой степени. Трихомонаду можно обнаружить с помощью влажного мазка, но этот метод нечувствителен. Доступны экспресс-тесты на АГн и методы на основе культивирования. ТАНК — это быстрый и чувствительный способ обнаружения трихомонад.
е) Серологическая диагностика. Серологические тесты в основном используются для диагностики инфекционных агентов, которые трудно культивировать in vitro или обнаружить путем прямого исследования, таких как Bartonella, Francisella, Legionella, Borrelia (болезнь Лайма), Treponema pallidum, Mycoplasma, Rickettsia, некоторые вирусы (ВИЧ, ВЭБ, HAV) и некоторые паразиты (Toxoplasma, Trichinella).
Тесты на АТл м.б. специфичными для IgG или IgM либо могут измерять ответ АТл независимо от класса Ig. В общих чертах реакция IgM возникает на более ранней стадии заболевания, обычно достигает пика через 7-10 дней после заражения и исчезает в течение нескольких недель, но при некоторых инфекциях (напр., гепатит А, лихорадка Западного Нила) он может сохраняться в течение нескольких месяцев. Пик IgG-ответа приходится на 4-6 нед и часто сохраняется на всю жизнь. Поскольку ответ IgM является временным, присутствие АТл IgM в большинстве случаев коррелирует с недавним инфицированием. Однако методы обнаружения АТл IgM трудно стандартизировать, и в некоторых случаях они дают л/п-результаты. Присутствие АТл IgG может указывать на новую сероконверсию или прошлое воздействие патогена.
Чтобы подтвердить новую инфекцию с помощью тестирования на IgG, важно продемонстрировать сероконверсию или повышение титра IgG. Четырехкратное увеличение титра у выздоравливающего, полученное через 3-4 нед после первого исследования в острый период заболевания, в большинстве случаев считается диагностическим. У новорожденных интерпретация серологических тестов затруднена вследствие пассивной передачи материнского IgG, который может сохраняться в течение 6-18 мес после рождения. Контекст чрезвычайно важен при интерпретации серологических результатов. Важными соображениями являются способность организма хозяина выработать иммунный ответ, фоновый уровень серопозитивности (особенно для тестов на определение IgG), а для некоторых заболеваний — титр АТл. Кроме того, интерпретация некоторых серологических анализов, напр. таких, которые используются для диагностики болезни Лайма, проблематична вследствие недостаточной специфичности иммуноанализов.
Подтверждающий иммуноблот (вестерн-блоттинг) требуется для всех положительных и сомнительных результатов ИФА на болезнь Лайма.
ж) Лабораторная диагностика вирусных инфекций. Вирусные заболевания чрезвычайно важны в педиатрии, и диагностическая вирусология уже давно играет важную роль в педиатрической практике, особенно в условиях стационара.
1. Образцы. Образцы для диагностики вирусных инфекций отбираются на основе знания локализации, где наиболее вероятно обнаружение предполагаемого патогена. При обследовании пациентов с ОРВИ отбор проб следует производить на ранней стадии развития инфекции, когда вирусовыделение имеет тенденцию к максимальному значению. Тампонами следует энергично протирать поверхность слизистой оболочки или кожи, чтобы получить как можно больше клеточного материала. Отправлять их следует в транспортной среде для вирусов, содержащей АБ для подавления роста бактерий. Ректальные мазки должны содержать видимое присутствие кала.
Было показано, что флокированные тампоны дают больше материала для лаборатории с последующим улучшением эффективности диагностических тестов. Жидкости и респираторные выделения следует собрать в стерильные контейнеры и незамедлительно доставить в лабораторию. Если ожидается задержка, все образцы следует перевозить на льду. Замораживание образцов, особенно при -20 °C (-4 °F), может привести к значительному снижению чувствительности культуры. Рекомендуется проконсультироваться с лабораторией, поскольку для некоторых коммерческих диагностических наборов, используемых лабораториями, могут потребоваться специальные устройства для сбора. Лабораторная диагностика вирусных инфекций может осуществляться с помощью электронной микроскопии, обнаружения АГн, выделения вируса в культуре, серологического тестирования или МАНК.
В последние несколько лет молекулярные тесты стали основным средством выявления вирусных инфекций, при этом некоторые вирусологические лаборатории вообще отказались от использования вирусных культур. Интересным событием стало появление одобренных FDA мультиплексных анализов, позволяющих одновременно обнаруживать несколько вирусов, а также невирусные агенты. Серологическое тестирование по-прежнему играет важную роль, особенно в отношении арбовирусных инфекций, таких как лихорадка Западного Нила, болезнь Зика, чикунгунья и лихорадка денге; острых инфекций, вызванных ВЭБ; ВИЧ; HAV; HBV; HCV; HDV; вируса гепатита Е и возбудителей детских инфекций, таких как корь, краснуха и паротит. Серология также уникально полезна для определения иммунитета к конкретным вирусным инфекциям.
2. Тесты на обнаружение антигена. Метод флуоресцирующих АТл или др., такие как ИФА, были основой диагностики ОРВИ, но теперь их заменяют молекулярные тесты. Анализ клеточного материала из респираторного секрета методом флуоресцирующих АТл позволяет идентифицировать АГн РСВ, аденовируса, вирусов гриппа А и В, вируса парагриппа 1-3-го типов и метапневмовируса человека в течение 2-3 ч после получения образца. Чувствительность окрашивания флуоресцирующих АТл к РСВ превышает чувствительность культивирования во многих лабораториях, но ниже, чем у молекулярных тестов. Для идентификации вируса ветряной оспы и ВПГ коммерчески доступны методы чувствительного иммунофлуоресцентного окрашивания. Также доступен метод обнаружения АГн рр65 ЦМВ в крови ИКП пациентов, но он в значительной степени замещен молекулярным тестированием. Метод флуоресцирующих АТл бесполезен для обнаружения вирусов в образцах, не содержащих достаточного количества инфицированных кл.
Экспресс-тесты на АГн обычно основаны на иммунохроматографии с латеральным потоком (аналогично экспресс-тестам на стрептококки группы А) и одобрены FDA для выявления вирусов гриппа А и В и РСВ. Последние модификации, повышающие чувствительность, включают флуоресцентные метки и считывающие устройства с инструментами. Некоторые экспресс-тесты на АГн не имеют статуса в соответствии с CLIA. Это означает, что они могут выполняться персоналом, не имеющим подготовки лабораторных технологов, с относительно небольшим формальным контролем качества, за исключением элементов управления, которые включены в тестовые устройства. Некоторые тесты выполняются в течение всего 10 мин. Следовательно, эти тесты м.б. выполнены в кабинете врача или в ОНМП. Чувствительность тестов у детей составляет 50-80% и, как правило, она выше, чем у взрослых.
Экспресс-тесты на АГн м.б. полезны при ведении пациентов с ОРВИ при условии, что лицо, осуществляющее уход, учитывает что отрицательный результат теста не исключает диагноза гриппа или РСВ.
Положительные тесты, которые правильно интерпретированы, обычно надежны, но наличие вируса, такого как грипп или РСВ, не исключает наличия сопутствующей бактериальной инфекции.
Помимо их роли в диагностике ОРВИ, тесты ИФА для обнаружения АГн часто используются для диагностики трудно культивируемых вирусов, таких как ротавирус, кишечный аденовирус и HBV. Обнаружение АГн р24 ВИЧ вместе с АТл к ВИЧ включено в тесты ИФА четвертого поколения, используемые в диагностическом алгоритме ВИЧ.
3. Вирусная культура. Вирусы нуждаются в живых кл. для репродукции; наиболее часто используемые кл. представляют собой монослои культур тканей человеческого или животного происхождения, такие, напр., как эмбриональные фибробласты легких человека или кл. почек обезьяны. Исторически также использовались методы in vivo, такие как инокуляция мышам-сосункам, но сегодня они применяются редко. Вирусный рост в восприимчивой клеточной культуре обычно достигается путем обнаружения характерного цитопатического эффекта, который виден с помощью световой микроскопии при малом увеличении в культивируемых кл. Наиболее надежный подтверждающий метод обнаружения вирусов в культуре кл. включает окрашивание моноклональными АТл, меченными флуоресцеином или ферментом, монослоев инфицированных кл.
Важным техническим усовершенствованием респираторных вирусных культур является разработка систем клеточных культур, которые включают >1 типа кл. (R-Mix, Diagnostic Hybrids/Quidel, San Diego, CA) и используют окрашивание методом флуоресцирующих АТл для обнаружения вирусов. Эта система дает результаты через 16-40 ч с момента поступления образца в лабораторию, по сравнению с 2-10 днями для обычных культур. Методы клеточных культур в настоящее время неуклонно заменяются молекулярными тестами, которые работают быстрее, м.б. более чувствительными и обнаруживать вирусы, которые не растут в клеточных культурах.
4. Молекулярная диагностика. Молекулярные тесты для обнаружения вирусов используют ПЦР и др. сопоставимые МАНК. Мультиплексные тесты, одобренные FDA, стали доступны для диагностики инфекций ДП, ЖКТ и ЦНС. Некоторые из этих тестов обнаруживают >20 различных агентов одновременно, и для их выполнения может потребоваться всего ~65 мин. Инфекционные агенты, обнаруживаемые мультиплексными панелями, могут включать бактерии, грибы и паразиты, а также вирусы (табл. 2).
ВПГ. ПЦР ликвора был первым, основанным на методе ПЦР тестом, получившим широкое распространение в середине 1990-х гг. Первый тест был одобрен FDA для этой цели в 2014 г. Некоторые лаборатории по-прежнему используют разработанные лабораторией тесты, рабочие характеристики которых должны быть подтверждены в соответствии с требованиями CLIA, в результате чего испытания не стандартизированы, а рабочие характеристики (ЧС) могут варьировать от лаборатории к лаборатории. Эффективные ПЦР-тесты СМЖ на ВПГ имеют ЧС >95/95% для диагностики ВПГ-энцефалита. ПЦР также все чаще используется для диагностики кожно-слизистых инфекций, вызванных ВПГ и вирусом ветряной оспы. Молекулярное тестирование более чувствительно, чем вирусная культура, и обеспечивает более быструю диагностику. Поскольку молекулярные тесты обнаруживают как нежизнеспособный, так и жизнеспособный вирус, они могут обнаруживать вирус на стадии реконвалесценции, когда посевы будут отрицательными.
Одобренный FDA высокочувствительный тест на энтеровирус в СМЖ (GeneXpert, Cepheid, Саннивейл, Калифорния) обеспечивает обнаружение энтеровирусов за ~3 ч. Поскольку это тестирование является простым, некоторые больничные лаборатории могут проводить его круглосуточно, что обеспечивает максимальную клиническую ценность теста. Пареховирусы, которые могут вызывать заболевания, аналогичные энтеровирусной инфекции, особенно у детей <6 мес, должны быть обнаружены с помощью отдельных молекулярных анализов.
Респираторные вирусы, обнаруживаемые с помощью мультиплексных панелей, включают вирусы гриппа А и В; РСВ; парагриппа 1-4; метапневмовирус человека; риновирус/энтеровирус; коронавирусы ОС43, 229Е, NL63 и HKU1; и аденовирусы (см. табл. 2). Конкретные вирусы (и невирусные агенты), включенные в тесты, различаются в наборах разных производителей.
Кроме того, доступны быстрые молекулярные тесты без сертификации CLIA для одновременного выявления гриппа А и В или гриппа A/В и РСВ. Эти тесты аналогичны не требующим сертификации молекулярным тестам на стрептококк группы А и могут сделать чувствительную молекулярную диагностику доступной в ОНМП, центрах НМП и кабинетах врачей. Молекулярные тесты дороже тестов на основе АГн, а исследования клинического применения и экономической эффективности пока недоступны.
Желудочно-кишечные мультиплексные панели, недавно одобренные FDA, могут включать тесты на ротавирусы группы А, норовирусы GI и GII, кишечные аденовирусы (группа F, серотипы 40 и 41), астровирус и саповирус, но не все они включены в тест каждого производителя. Также включены тесты на наличие бактериальных и паразитарных возбудителей. Для клиницистов эти исследования предоставляют информацию о наличии потенциальных этиологических агентов, ранее не доступных. Возникает множество вопросов о том, действительно ли обнаруженные патогены являются клинически значимыми, и как отсортировать обнаружение >1 патогена в одном образце. Для лабораторий эти тесты вызывают вопросы о том, могут ли они заменить ранее использованные методы, такие как бактериальный посев. Клиническая полезность и экономическая эффективность использования этих исследований не определены.
Мультиплексная панель для вирусных, бактериальных и одного микотического агента инфекции ЦНС была одобрена FDA. Этот тест предоставляет информацию о наличии различных этиологических агентов, с которыми ранее сталкивались многие лаборатории. Что касается др. мультиплексных молекулярных панелей, их клиническую применимость и рентабельность еще предстоит определить. Восприимчивость к контаминации во время проведения анализа была проблемой, которая еще не решена.
Еще одна важная область применения молекулярного тестирования — обнаружение вирусов в крови. Одобренные FDA анализы для обнаружения РНК ВИЧ и РНК HCV важны для лечения этих инфекций, включая предотвращение передачи от матери ребенку. Также все чаще используется молекулярное тестирование на HBV. Кроме того, в настоящее время молекулярное тестирование широко используется для выявления вирусов, вызывающих системные заболевания у ИКП, особенно ЦМВ, ВЭБ, ВПГ, полиомавируса ВК и аденовируса. Вирус ВК часто определяется в образцах мочи, а также в крови. Для этих вирусов, а также для вирусов ВИЧ и гепатита требуется количественное тестирование. Теперь доступен одобренный FDA анализ ПЦР для количественного измерения ДНК ЦМВ в плазме.
Кроме того, были разработаны международные стандарты для детекции вирусов ЦМВ, ВЭБ и полиомавируса ВК. Это важно, потому что их использование улучшает сопоставимость уровней вирусной нагрузки, определенной в различных лабораториях. ПЦР-диагностика и др. молекулярные анализы используются некоторыми лабораториями для множества др. вирусов, включая парвовирус В19, ВГЧ 6, ВПЧ, эпидемического паротита, кори, краснухи и полиомавируса JC.
Паттерны экспрессии генов-хозяев в цельной крови были использованы для попытки дифференцировать вирусные от бактериальных инфекций. Этот подход может быстро идентифицировать вирусный или бактериальный профиль повторения экспрессии гена-хозяина, что значительно сокращает время до постановки диагноза и потенциально позволяет избежать несоответствующего лечения, при этом помогая в выборе этиотропной терапии. Внедрение в клинике предполагает разработку экспресс-тестов, включающих эту информацию.
