Характеристика регуляторных областей НФ2 важна для скрининга мутаций как спонтанных, так и семейных опухолей, в которых не была обнаружена мутация в НФ2-кодирующей области. Мы показали, что для полной активности промотора НФ2 требуется транскрипция НФ2 гена, начатая на нескольких стартовых сайтах и нескольких регионах в промоторе НФ2.
Как положительные, так и отрицательные регуляторные элементы, необходимые для транскрипции НФ2 гена были, найдены в 5‘-фланкирующей области промотора. В частности, последовательность с большим количеством гуанина и цитозина в нуклеотидных основаниях расположена в проксимальной регулятивной области, которая может быть связана с фактором транскрипции Sp1, действующего в качестве положительного регуляторного элемента.68 Как описывалось ранее, эта область является участком гена, граничащим с регионом кодирования 5‘, который либо положительно, либо отрицательно регулирует трансляцию ДНК в информационную РНК.
И 5‘- и 3‘- фланкирующие области человеческого НФ2 локуса содержат большое количество гуанина и цитозина, и как форма терапии могут использоваться в качестве мишени для метилирования и инактивации гена.
Мы также показали, что в 2.4-kb человеческого НФ2 промотора может определять, где произойдет экспрессия гена НФ2 еще на пятый день эмбрионогенеза. В период раннего развития сильная промогорная активность НФ2 была замечена в развивающемся мозге и сайтах, содержащих мигрирующие клетки, включая закрытие нервной трубки и жаберных дуг.
Интересно, что было отмечено преходящее изменение активности промотора НФ2 во время миграции клеток нервного гребня. В то время как небольшая активность промотора была замечена в премигрирующих клетках нервного гребня в области спинного гребня, значительная активность наблюдалась в клетках нервного гребня, уже мигрировавших в спинную нервную трубку. Кроме того, мы обнаружили значительную НФ2 промоторную активность в различных пораженных НФ2 тканях, таких как акустический и тройничный ганглии, спинномозговые ганглии, перекрест зрительных нервов, эпендимальные клетки, содержащие сосудистую основу и пигмент ный эпителий сетчатки.
Модель экспрессии НФ2 промотора во время эмбриогенеза предполагает определенное регулирование НФ2 гена при миграции клеток нервного гребня и далее поддерживает роль мерлина в неспецифической адгезии клеток, моторике и пролиферации в ходе развития.
Экспрессия НФ2 промоутера в нервной трубке и нервном гребне.
Боковой вид тотального препарата Х-gal-окрашенных эмбрионов мышей. А, Е9.5, Б, Е10.5, 8, Е12.5, и Г, Е14.5.
Измерительная линейка 400 м. Наиболее интенсивная экспрессия β-gal обнаружена вдоль спинного закрытия (стрелка) нервной трубки в Е9.5 (Д) и Е10.5 (Е) трансгенных эмбрионов.
Выраженная экспрессия β-gal наблюдалась также в жаберных дугах I—IV (стрелки) Ж, Е10.5 эмбриона.
Альтернативное сплайсирование НФ2 изоформ мРНК в вестибулярных шванномах и других типах клеток
НФ2 ген подвергается альтернативному сплайсингу в кодирующих экзонах. Множество альтернативно сплайсированных транскриптов НФ2 были выявлены в различных клетках человека. Наиболее распространенными изоформами этих клеток были изоформа II (содержащая все 17 экзонов) и изоформа I (без экзона 16). Мы также исследовали экспрессию альтернативного сплайсинга НФ2 изоформ мР-НК в вестибулярной шванноме (ВШ).
Клонирование и анализ последовательности показали, что характер экспрессии и относительная частота альтернативного сплайсинга НФ2 копий в вестибулярной шванноме (ВШ) отличны от тех, которые обнаружены в других типах человеческих клеток. В дополнение к изоформам I и II, эти шванномы экпрессируют высокий процент НФ2 изоформ, лишенных экзонов 15 и 16. Копии альтернативного сплайсинга НФ2 могут кодировать различные белковые продукты (неопубликованные данные).
В настоящее время не до конца понятна роль альтернативного сплайсинга НФ2 мРНК. Вполне возможно, что функциональный вклад супрессоров опухолей НФ2 может потребовать сбалансированной экспрессии различных изоформ белков в шванновские клетки и/или другие клеточные линии. Может быть другой механизм альтернативного сплайсинга шванновских клеток для инактивации функции мерлина и/или создания изоформ, обладающих дополнительными свойствами, которые способствуют образованию опухолей.
