Векторы, плазмиды в молекулярной генетике. Что такое вектор, плазмида?
Вектор — молекула ДНК, способная к автономному копированию в клетке-хозяине, например бактериальной или дрожжевой клетке, из которой ее можно впоследствии выделить в чистой форме для анализа. Если с помощью ДНК-лигазы включить в вектор фрагмент ДНК человека, такую новую молекулу ДНК можно внести в бактериальную клетку для размножения включенного фрагмента вместе с молекулой вектора.
Репликация векторов может привести к появлению большого числа копий на одну клетку, а бактерии-хозяева могут расти в лаборатории бесконечно долго, производя значительные и легкодоступные количества включенной ДНК-последовательности. Объединение молекулы ДНК из различных источников, например фрагментов ДНК человека и вектора, называется технологией рекомбинантной ДНК. Обычно с этой целью используют множество векторов, каждый со своими преимуществами и ограничениями, но мы ограничим внимание наиболее часто используемым вектором — плазмидой.
Плазмиды
Плазмиды, используемые как векторы — кольцевые двойные молекулы ДНК, отделившиеся от бактериальной или дрожжевой хромосомы, способные к копированию независимо от собственных хромосом микроорганизма. Векторные плазмиды — производные от молекул естественного происхождения, сначала были обнаружены в бактериях.
Поскольку они несли гены устойчивости к антибиотикам и могли легко переходить от одной бактерии к другой, плазмиды быстро распространяли устойчивость к антибиотику во всей микробной популяции.
Специально созданные для молекулярного клонирования плазмиды обычно невелики (несколько килобаз величиной) и содержат три обязательных компонента: оригинал для репликации (копирования в кишечной палочке или в дрожжах), один или более избирательных маркеров (например, ген, определяющий устойчивость к антибиотикам) и один или более сайтов рестрикции, которые могут быть использованы для удаления чужеродной ДНК.
Важные этапы, связанные с клонированием в плазмиде чужеродной ДНК с сайтом рестрикции EcoRI. Идентификация колоний, которые содержат искомую рекомбинантную плазмиду с последующим массовым ростом и выделением чистой плазмидной ДНК, позволяет накопить большие количества клонированной вставки. Некоторые плазмиды, оказавшиеся особенно полезными в ходе молекулярного клонирования, используются как ВАС (ВАС-векторы). ВАС-векторы — специально разработанные плазмиды, содержащие большие вставки ДНК, от 100 до 350 килобаз.
Разработка технологии ВАС потребовала многочисленных модификаций в генах плазмид и несущих бактерий, гарантирующих, что большие вставки чужеродной ДНК останутся стабильными и будут правильно копироваться в ходе деления бактерии-хозяина. Технология ВАС-векторов сыграла критически важную роль в проекте «Геном человека», позволив разделить весь геном человека на фрагменты, пригодные для анализа методом секвенирования.