Скрининг библиотек гибридизационными зондами в молекулярной генетике. Особенности
Как только библиотека создана, следующим шагом должна стать идентификация клонов, несущих интересующую последовательность, среди миллионов клонов, несущих другие фрагменты. Поиск клонов, несущих интересующий участок ДНК, называется скринингом библиотеки. Скрининг библиотек часто выполняют гибридизацией нуклеиновых кислот.
В самой общей форме реакция гибридизации происходит при смешении однонитевых нуклеиновых кислот при определенной температуре и концентрации солей, в которых происходит только правильное спаривание нуклеотидов (аденина с тимином, а гуанина с цитозином) между нитями ДНК. Только такие нити формируют стабильную двухнитевую нуклеиновую кислоту; несовпадающие нуклеотидные последовательности не могут сформировать стабильную молекулу.
Гибридизация нуклеиновых кислот — фундаментальное понятие молекулярной биологии. Эту технологию применяют не только для скринирования библиотек клонов ДНК, но даже чаще для анализа ДНК или РНК в клетках и тканях, о чем рассказано в последующих разделах этой главы.
Полезность нуклеиновых зондов определяется специфичностью гибридизации между комплементарными нитями. Одну последовательность («мишень») в смеси нуклеиновых кислот тестируют по своей способности формировать стабильную двойную спираль с ДНК или фрагментом РНК известной последовательности («зондом»), меченой радиоактивной меткой, гистохимическим реактивом или флуоресцентной краской, что позволяет впоследствии обнаружить зонд.
Если зонд комплементарен с целевой последовательностью, он формирует стабильную двухнитевую молекулу. Теперь целевая последовательность в исходном образце ДНК или РНК может быть определена по метке зонда, таким образом облегчая последующее ее обнаружение, выделение и анализ.
Пометив зонд радиоактивной меткой, например фосфором-32 (32Р), можно выявить метку по следу на рентгеновской пленке. С помощью ряда методов радиоактивный фосфор вводят в зонд, заменяя обычный фосфор в фосфатной группе нити ДНК. Зонды также могут быть помечены флюоресцентными красителями. Зонд синтезируют из нуклеотидов, в которые включена флюоресцентная метка (сегодня доступно множество различных флюоресцентных красителей).
Каждый краситель возбуждается светом с определенной длиной волны и испускает свет с характерной для него длиной волны. Флюоресценция зонда регистрируется методом цифровой фотографии и, следовательно, пригодна для компьютерной обработки.
Зонды можно получать из множества различных источников. Они могут быть клонированной геномной или кДНК, фрагментами, сгенерированными методом ПЦР (см. последующую дискуссию) или химически синтезированными из нуклеиновых кислот молекулами (ДНК или РНК). Зонды, полученные клонированием ДНК или созданные при ПЦР, обычно имеют длину от нескольких сотен до нескольких тысяч нуклеотидов. Химически синтезированные однонитевые ДНК зонды, обычно от 18 до 60 нуклеотидов длиной, известны как «олигонуклеотидные зонды» или просто олигонуклеотиды.
