Аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды в молекулярной генетике. Особенности
При некоторых генетических болезнях одна и та же мутация ответственна за значимую долю случаев. Это, например, мутация, вызывающая серповидноклеточную анемию, изменяющая единственный нуклеотид и приводящая к замене глутаминовой кислоты на валин в молекуле бета-глобина, или трехнуклеотидная делеция в гене трансмембранного белка-переносчика при муковисцидозе, составляющая до 60% всех случаев тяжелых форм муковисцидоза у европеоидов.
В других случаях приходится искать редкую мутацию у члена семьи, в которой она уже была выявлена ранее. В перечисленных ситуациях можно провести прицельный анализ ДНК на наличие или отсутствие конкретной мутации у пациента. Лучший зонд для обнаружения однонуклеотидной мутации или небольшой делеции или инсерции — синтетический олигонуклеотид, поскольку небольшая длина делает его чувствительным даже к единичным несовпадениям нуклеотидных пар между зондом и анализируемым образцом.
Олигонуклеотидный зонд, синтезированный в точном соответствии с нормальной последовательностью ДНК гена [аллель-специфический олигонуклеотид (АСО)], гибридизируется только с нормальной комплементарной последовательностью, и никогда — с последовательностью, в которой есть хотя бы одно несовпадение с зондом. Аналогично аллель-специфичный олигонуклетидный-зонд, комплементарный к последовательности мутантного гена, гибридизируется только с ним, а не с нормальным геном.
Важно понимать различие между аллель-специфичным олигонуклетидным-анализом и стандартным анализом по Саузерну. В большинстве случаев при использовании стандартных зондов в Саузерн-блоттинге мутантные гены с одно-нуклеотидными заменами или другими «малыми» мутациями ДНК (например, небольшими делениями или инсерциями) неотличимы от нормальных.
Только короткие аллель-специфичные олигонуклеотидные зонды способны надежно обнаруживать однонуклеотидные замены.
Аллель-специфичный олигонуклеотидный-анализ позволяет провести точную идентификацию конкретной последовательности ДНК и различать индивидуумов, несущих нормальную последовательность ДНК в гомологичных хромосомах, мутантную последовательность как в гомологичных хромосомах, так и в одной хромосоме при нормальной последовательности в другом гомологе.
Тем не менее в ходе интерпретации результатов аллель-специфичного олигонуклетидного-анализа необходима осторожность, поскольку не все мутантные гены в одном локусе несут одинаковые изменения последовательности ДНК. Таким образом, отсутствие гибридизации гена со специфическим мутантным АСО-зондом не обязательно означает, что этот ген нормален; возможна мутация в позиции, не проверяемой конкретным аллель-специфичным олигонуклетидным зондом.
