ПЦР — альтернатива клонированию для получения, в сущности, неограниченных количеств интересующей ДНК-последовательности. ПЦР за несколько часов может избирательно увеличить в количестве единственную молекулу ДНК до нескольких миллионов копий, что революционизировало как молекулярную диагностику, так и молекулярный анализ генетических болезней.
ПЦР — ферментативное «умножение» или амплификация фрагмента ДНК, расположенного между двумя олигонуклеотидами, так называемыми праймерами. Праймеры разрабатывают таким образом, что первый комплементарен одной нити молекулы ДНК с одной стороны целевой последовательности, а второй — другой нити противоположной стороны этой же последовательности.
Олигонуклеотидные праймеры таким образом фланкируют целевую последовательность, а их 3'-концы направлены к амплифицируемой последовательности. Затем, используя последовательность между праймерами как шаблон, с помощью ДНК-полимеразы синтезируются две новые нити ДНК. Вновь синтезированные комплементарные нити ДНК формируют следующую копию исходной целевой последовательности.
Регулярные циклы тепловой денатурации, гибридизации праймеров и ферментативного синтеза ДНК приводят к экспоненциальному росту (2, 4, 8,16, 32,...) числа копий целевой последовательности ДНК. В результате количество копий участка ДНК между праймерами будет увеличиваться до тех пор, пока не израсходуются субстраты реакции (праймеры и нуклеотиды). При использовании специально разработанных приборов для ПЦР цикл амплификации занимает всего несколько минут. Таким образом, в течение нескольких часов могут быть получены миллиарды копий стартовой молекулы ДНК.
ПЦР может генерировать достаточные для анализа мутаций количества специфических генов из образцов ДНК. Конкретные части генов (обычно экзоны) быстро амплифицируются с помощью специфичных праймеров. Амплифицированный сегмент затем может или быть легко секвенирован, или протестирован методом АСО-гибридизации для обнаружения мутации. Анализ ДНК, генерируемой в ходе ПЦР, может быть выполнен менее чем за один день, существенно облегчая разработку и клиническое использование большого числа диагностических ДНК-тестов.
ПЦР также можно использовать при анализе небольших количеств РНК, эта процедура называется амплификацией продуктов обратной транскрипции (RT-PCR). Сначала, с помощью того же фермента обратной транскриптазы, которую используют для изготовления библиотек клонов кДНК, на основе интересующей мРНК синтезируется однонитевая кДНК. Затем добавляют праймеры для ПЦР вместе с ДНК-полимеразой, так же как при ПЦР ДНК. Один из олигонуклеотидов запускает синтез второй нити кДНК, полученная двойная спираль затем служит в качестве объекта ПЦР.
ПЦР, по сравнению с любым другим методом анализа, чрезвычайно чувствительная, более быстрая, менее дорогая и нетребовательная к образцам пациентов методика. Она позволяет обнаружить, проанализировать и измерить специфические последовательности гена в образце ДНК пациента, не клонируя его и не прибегая к блоттингу.
Анализ можно выполнять даже из нескольких клеток буккального эпителия после полоскания рта, из единственной клетки, взятой у 3-дневного эмбриона, содержащего четыре или восемь клеток, из спермы во влагалищном тампоне, полученном от жертвы изнасилования, или из капли сухой крови на месте преступления. ПЦР, таким образом, устраняет необходимость в получении больших количеств ДНК или РНК из образцов ткани и становится стандартным методом анализа ДНК и РНК в клинической диагностике и криминалистике.
Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР)
ПЦР также можно выполнять как количественный анализ для измерения объема конкретной последовательности ДНК в образце. В начале ПЦР количество молекул амплифицируемой области ДНК с каждым циклом денатурации, гибридизации праймеров и синтеза ДНК увеличивается вдвое. Если построить график увеличения вещества, синтезированного в начале ПЦР, мы получим на полулогарифмическом графике прямую линию, показывающую, что объем продукта удваивается с каждым циклом.
Количество циклов, требуемых для достижения некоего произвольного порога, зависит от того, сколько шаблона первоначально присутствовало в начале ПЦР: чем меньше циклов необходимо для достижения данного порога, тем больше шаблона, по-видимому, присутствовало вначале. Эту технику, известную как ПЦР в реальном времени, наиболее часто используют для измерения небольших количеств одной конкретной ДНК или РНК в одном образце (образец А) относительно контрольного количества РНК или ДНК в другом образце (образец Б). Важно, чтобы эффективность амплификации образца А и образца Б были сравнимыми, т.е. два прямых сегмента на графике должны быть параллельными.
Видео методика и принципы ПЦР (полимеразной цепной реакции) в диагностике
