• Полимеризация микротрубочек начинается с образования некоторого количества центров полимеризации (небольших полимерных комплексов)
• Микротрубочки образуются при добавлении субъединиц тубулина к обоим ее концам
• В растворе всегда сохраняется критическая концентрация субъединиц тубулина. Для того чтобы происходила сборка трубочек, концентрация тубулина должна быть выше некоторого критического значения
Микротрубочки образуются при полимеризации единиц тубулина. Этот процесс можно изучать in vitro, используя препараты очищенного тубулина. Для образования микротрубочек сначала тубулин и ГТФ растворяют в соответствующем буфере, а затем раствор нагревают до 37 °С, чтобы начать полимеризацию (эти условия используют при изучении полимеризации тубулина из клеток млекопитающих). Образование микротрубочек легко контролировать с помощью измерения светорассеяния, поскольку в отличие от молекул тубулина, образующиеся полимерные продукты рассеивают свет. Величина светорассеяния пропорциональна количеству образующегося полимера, из которого состоят микротрубочки.
На рисунке ниже представлена зависимость образования полимера от времени. Началу процесса предшествует лаг-период, в течение которого полимер не образуется. Затем начинается образование полимера, количество которого линейно нарастает до достижения плато. Начальная фаза, при которой не обнаруживается полимера, называется фазой спонтанной нуклеации. Во время этой начальной лаг-фазы начинают образовываться небольшие центры полимеризации, состоящие лишь из нескольких субъединиц тубулина.
Графическая иллюстрация зависимости образования полимера микротрубочек от времени при полимеризации очищенного тубулина in vitro.
Вначале не происходит образования полимера. Затем, его количество со временем увеличивается линейно и выходит на плато.
В течение каждой из трех стадий происходят различные молекулярные процессы.
Эти центры неустойчивы, поскольку с большей вероятностью подвергаются диссоциации, чем присоединяют дополнительные субъединицы. Однако некоторые могут расти дальше. Когда произошло объединение достаточного количества субъединиц (6-12), центр приобретает устойчивость, поскольку он с большей вероятностью начинает расти, чем диссоциировать. Поскольку образование достаточно крупных центров полимеризации затруднено, их возникновение является этапом, лимитирующим скорость процесса формирования микротрубочек. Клетки обладают специфическими белковыми комплексами, которые позволяют им преодолевать низкую скорость спонтанной полимеризации, ускорять этап нуклеации и устанавливать время его наступления.
Линейное увеличение количества полимера происходит за счет присоединения субъединиц тубулина к концам центров образования микротрубочек («ядрам»), которые образуются при спонтанной нуклеации. Каждая микротрубочка удлиняется за счет добавления субъединиц к обоим (плюс- и минус-) ее концам. Также происходит и диссоциация субъединиц, однако с гораздо меньшей частотой. В результате происходит наращивание субъединиц, как показано на рисунке ниже. Суммарная скорость роста определяется скоростью добавления субъединиц и их диссоциацией и описывается уравнением 7.1:
где dP/dt — количество полимера, образующегося в единицу времени, [тубулин] — концентрация молекул тубулина в растворе, kon — константа скорости полимеризации (ед. М-1 с-1), a koff — скорости диссоциации (ед. с-1). Значения констант скорости для плюс- и минус-концов микротрубочек различаются, и поэтому для каждого конца полимера существует свое уравнение 7.1. Как следует из уравнения 7.1, при большей концентрации тубулина микротрубочки образуются быстрее.
В конце концов количество полимера достигает максимума по мере достижения системой стационарного состояния, при котором добавление субъединиц уравновешивается их диссоциацией. Когда образовалось максимальное количество полимера, часть субъединиц тубулина остается в растворе. Эта концентрация тубулина называется критической концентрацией (Сс), и она одинакова независимо от величины исходной концентрации. Если выразить критическую концентрацию математически, то легко понять, почему это так. В равновесном состоянии образования полимера не происходит, и т. о. dP/dt в уравнении 7.1 равняется нулю. При этом условии уравнение решается для тубулина:
Критическая концентрация для очищенного тубулина составляет около 7 мкМ. Поскольку это такая концентрация субъединиц, которая всегда остается в растворе в состоянии равновесия, то концентрация димеров тубулина должна быть выше критической с тем, чтобы полимер мог образоваться. Аналогичным образом, если в состоянии равновесия полимеры присутствуют в большом количестве, то общая концентрация тубулина оказывается пониженной, то полимеры начинают диссоциировать, и их количество понижается.
Это прекращается, когда концентрация растворимых субъединиц тубулина снова достигнет критического значения. Таким образом, критическую концентрацию можно представить как минимальную, необходимую для образования микротрубочек.
Важным является вопрос о судьбе индивидуальных микротрубочек при наступлении состояния равновесия. Наиболее простая возможность заключается в том, что, подобно большинству химических реакций, полимеризация микротрубочек на обоих концах приходит к состоянию равновесия с молекулами тубулина, находящимися в растворе. Если бы это имело место, наблюдался бы очень незначительный обмен субъединиц микротрубочек. Причины этого будут изложены. Экспериментальные данные, однако, свидетельствуют об обратном: в состоянии равновесия добавление и диссоциация субъединиц происходит достаточно интенсивно, т. е. гораздо интенсивнее, чем это можно ожидать исходя из представлений об обмене в состоянии равновесия.
Это говорит о том, что в действительности происходит более сложный процесс, чем достижение простого равновесия. Механизмы, ответственные за столь усиленный обмен компонентов полимера, являются основополагающими для понимания поведения микротрубочек и обсуждаются в отдельных статьях на сайте (рекомендуем пользоваться пормой поиска на главной странице).
Упрощенная схема нуклеации микротрубочек.
Небольшое количество димеров может объединяться, однако обычно комплекс распадается.
Впрочем, в отдельных случаях происходит добавление дополнительных димеров и их ассоциация.
Если образовался комплекс из 6-12 димеров, то он с большей вероятностью будет продолжать расти.
Образуется небольшой слой протофиламентов, который в конце концов формирует короткую микротрубочку, часто называемую «затравкой».
После образования затравки микротрубочки происходит ее элонгация за счет добавления субъединиц с обоих концов.
Один конец растет быстрее другого. Этот рост приводит к линейному увеличению общего количества полимера,
которое наступает после фазы спонтанной нуклеации.
