• Белки, связанные с микротрубочками (MAP), регулируют их сборку, стабилизируя или дестабилизируя микротрубочки
• MAP определяют степень вероятности роста или диссоциации микротрубочки
• MAP могут присоединяться к различным сайтам на микротрубочках. Некоторые белки связываются с телом трубочки, некоторые только с концами. Другие связываются только с димерами тубулина, предотвращая их дальнейшую полимеризацию
• Оборачиваемость микротрубочек регулируется изменением баланса между активными стабилизаторами и дестабилизаторами
• Активность MAP регулируется их фосфорилированием
• MAP также способны связывать мембраны или белковые комплексы с микротрубочками
Являясь компонентом цитоскелета, микротрубочки используются клеткой для выполнения разнообразных функций. В одних случаях необходимы стабильные микротрубочки, в других используются динамические. Часто в клетках, к стенкам или концам микротрубочек присоединяются органеллы или другие структуры (включая прочие компоненты цитоскелета). Для выполнения всех этих задач клетки используют ряд белков, которые называются белками, связанными с микротрубочками (англ. microtubule-associated proteins, MAP). Некоторые MAP модифицируют динамическую нестабильность, активируя или ингибируя процессы полимеризации или деполимеризации тубулина на концах микротрубочек.
Другие функционируют в качестве линкеров между концами микротрубочек и мембранными везикулами или другими микроструктурами. Некоторые МАР выполняют обе функции, регулируя сборку микротрубочек и связывание с ними различных компонентов.
Впервые МАР были идентифицированы в составе белков препаратов микротрубочек, выделенных из ткани головного мозга млекопитающих. Эта процедура схематически представлена на рисунке ниже. Два белка, названные МАР2 и tau, обнаружены только в нейронах, и обеспечивают существование долгоживущих микротрубочек, необходимых для функционирования аксонов и дендри-тов. Они присоединяются вдоль тела микротрубочек Поскольку эти белки присоединяются сразу к нескольким субъединицам тубулина, они определяют частоту наступления переходов динамической нестабильности.
Оба белка подавляют наступление катастроф и сильно увеличивают вероятность спасения микротрубочек, тем самым делая маловероятной их разборку. В результате образуются длинные микротрубочки, которые существуют гораздо дольше, чем это возможно для микротрубочек, содержащих только тубулин. Обычно эти белки связываются по длине всей микротрубочки, покрывая ее поверхность, и выглядят как скобы, укрепленные на стенке микротрубочки, сильно затрудняющие отщепление субъединиц.
Показано, как были идентифицированы первые MAP.
Для этого использовали головной мозг, поскольку нейроны содержат много микротрубочек.
Ткань мозга гомогенизировали в среде, вызывающей деполимеризацию микротрубочек.
При последующем центрифугировании удалялись неразрушенные тканевые фрагменты,
и в супернатанте оставались только растворимые белки, включая тубулин, который содержится во всех микротрубочках нейронов головного мозга.
После деполимеризации тубулина микротрубочки осаждали повторным центрифугированием.
Наряду с а- и b-тубулином, обнаруживалось много других белков.
Некоторые белки связываются только с плюс-концами микротрубочек. Они обозначаются как «+TIPs». Если пометить эти белки флуоресцентной меткой, они будут выглядеть как короткие участки, расположенные на плюс-концах микротрубочек. +TIPs связываются с микротрубочкой только при наличии растущего плюс-конца и, по-видимому, способны перемещаться на растущий конец. На рисунке ниже представлена микрофотография клетки, экспрессирующей флуоресцентно меченый +TIP. Видеосъемка показывает, что белок выглядит как множество небольших комет, движущихся в цитоплазме, причем каждая комета соответствует растущему концу отдельной микротрубочки.
Предполагается, что по мере добавления новых тубулиновых субъединиц к растущему концу микротрубочки к ним присоединяются индивидуальные белки +TIP. Каждый белок остается связанным с микротрубочкой лишь в течение короткого времени и затем отщепляется. Пока белок находится в связанном состоянии, микротрубочка продолжает расти, и к ней все время добавляются новые +TIPs. Постоянное добавление белков +TIP к концу микротрубочки и их отщепление, когда они оказываются позади зоны роста, позволяет прийти к выводу, о том, что концентрация связанного +TIP белка на концах микротрубочек всегда выше.
С концами микротрубочек связываются несколько различных групп белков. Один из белков, родственный +TIP, обнаружен в различных клетках и называется CLIP-170. Этот белок служит примером MAP белка, обладающего двумя функциями, поскольку он способен стабилизировать микротрубочки, способствуя их спасению, а также связывать с ними эндосомы.
Когда в клетке возникает необходимость в очень динамичных микротрубочках, например в митозе, их обмен возрастает. При этом скорость обмена субъединиц увеличивается за счет MAP которые снижают стабильность микротрубочек. В основе дестабилизирующего действия белков лежит увеличение вероятности наступления катастроф, приводящих к укорачиванию микротрубочек. Они также снижают вероятность наступления спасений и до начала возобновления роста микротрубочки теряют много своих субъединиц. Дестабилизаторы реализуют свое действие по трем механизмам: они способны разрушать ГТФ-кэпы и стимулировать наступление катастроф; они могут разрезать микротрубочки на куски с образованием множества концов, способных к диссоциации; и наконец, они связывают свободные тубулиновые субъединицы, что снижает доступное для полимеризации количество тубулина. Эти механизмы представлены на
Разрезание микротрубочек происходит с помощью белка катанина, который получил свое название от японского слова «катана», что значит меч. Катанин действует, связываясь со стенкой микротрубочки и нарушая контакты между субъединицами тубулина. Для образования разреза необходимо присоединение к микротрубочке нескольких молекул катанина, а также гидролиз АТФ. Хотя механизм разрезания микротрубочек вполне понятен, пока не ясно, каким образом катанин реализует свою активность в клетке. Белок обнаружен во всех клетках, и исследования на мутантах и с применением ингибиторов свидетельствуют о том, что он участвует в основных клеточных процессах.
Например, в клетках некоторых организмов катанин необходим для сборки митотического веретена. Также белок требуется для организации микротрубочек в клетках растений. Однако в обоих случаях непонятно, каким конкретным образом он реализует свой эффект в клетке. Возможно, что он ускоряет деполимеризацию длинных микротрубочек, разрезая их на несколько частей. Это особенно необходимо для крупных клеток, таких как яйцеклетка. Впрочем, катанин может играть и другую роль. Он обнаружен в центросомах некоторых клеток, и предполагается, что белок принимает участие в отделении новообразованных микротрубочек от ЦОМТ.
Примером белка, дестабилизирующего микротрубочки за счет разрушения ГТФ-кэпа, служит кинезин, связанный с митотической центромерой (МСАК). Он является представителем группы молекулярных моторов — кинезинов и играет важную роль в контроле динамики микротрубочек в митозе. В отличие от большинства белковых моторов, МСАК не транспортирует различные молекулы. Он лишь связывается с концами микротрубочек и дестабилизирует их структуру, способствуя образованию протофиламентов, которые отклоняются от прямолинейной ориентации. Такие закрученные протофиламенты теряют контакт с соседними субъединицами, разрушается ГТФ-кэп, и микротрубочка начинает укорачиваться. Затем из деполимеризующихся тубулиновых субъединиц высвобождается МСАК, который снова может связаться с микротрубочками.
Насколько динамичными являются микротрубочки в определенный момент времени, зависит от состояния баланса между стабилизаторами и дестабилизаторами. Сдвиг баланса при активации или инактивации различных МАР повлечет за собой или увеличение стабильности микротрубочек, или усиление обмена субъединиц. Предположение о том, что динамика микротрубочек регулируется за счет баланса между стабилизирующими и дестабилизирующими МАР, впервые было выдвинуто при исследовании двух МАР из яйцеклеток лягушки — ХМАР215 (стабилизатор микротрубочек) и МСАК. Удаление из клеток белка ХМАР215 приводит к относительному увеличению содержания белка МСАК; в результате этого в клетке образуются очень короткие микротрубочки, и увеличивается частота наступления катастроф.
Напротив, удаление МСАК благоприятствует смещению баланса в сторону более стабильных микротрубочек, которые достигают значительной длины, поскольку катастрофы наступают редко. Необходим надлежащий баланс между ХМАР215 и МСАК; в противном случае образуется функционально неполноценное веретено деления.
Каким образом регулируется активность MAP? Вообще говоря, изменения стабильности микротрубочек наступают слишком быстро для того, чтобы они обеспечивались экспрессией генов, кодирующих MAP. Поэтому активность многих MAP регулируется степенью их фосфорилирования. Например, при фосфорилировании белка tau его сродство к микротрубочкам снижается. Это приводит к снижению стабилизирующих свойств белка. Фосфорилирование MAP не обязательно проходит во всей клетке. При локальной активации киназы в небольшой области клетки активность MAP может измениться только в этой области. Переключая функции стабилизаторов и дестабилизаторов между состояниями «включено» и «выключено», клетка может поддерживать баланс, обеспечивающий присутствие более стабильных или более динамических микротрубочек.
За счет локального изменения активности MAP, клетка может реагировать на поступление внешних сигналов, обеспечивая в определенных своих частях рост более длинных микротрубочек или их диссоциацию. Локальная регуляция активности MAP происходит при изменении клеточной подвижности и, в частности, при сборке митотического веретена.
Фосфорилирование белка tau связано с болезнью Альцгеймера, хотя и не показано, что изменение динамики микротрубочек играет роль при этом заболевании. Когда tau белок подвергается гиперфосфорилированию, он образует фибриллярные агрегаты, которые можно наблюдать в головном мозге больных. Неясно, являются ли изменения белка tau, которые развиваются при болезни Альцгеймера, причиной или следствием патологического процесса. Хотя причинная роль изменений белка tau при болезни Альцгеймера не установлена, некоторые другие нейродегенеративные заболевания вызываются мутациями по гену tau и также приводят к образованию фибриллярных агрегатов tau белка и к развитию болезни.
Фотография участка клетки, сделанная с помощью флуоресцентного микроскопа.
Тубулин флуоресцирует красным, а белок ЕВ1, представитель семейства МАР, который связывается только с плюс-концами растущих микротрубочек, — зеленым.
Ядро обладает синей флуоресценцией. Белок ЕВ1 присутствует только в коротких элонгированных сегментах на концах микротрубочек.
Одна из рамок видеосъемки эпителиальной клетки, показывающая флуоресцирующий +TIP и ЕВ1 белок, связанные с концами микротрубочек.
Поскольку белки +TIP связываются с растущими концами микротрубочек, они выглядят как флуоресцирующие кометы, «пролетающие» по цитоплазме.
Фактически это движение отражает рост микротрубочек.
Механизм связывания и высвобождения белков +TIP,
позволяющий им локализоваться на растущем конце микротрубочки.
Три пути дестабилизации микротрубочек.
Удаление ГТФ-кэпа или разрыв трубочки приводят к обнажению концевых ГДФ-субъединиц и вызывают диссоциацию.
При разрыве также увеличивается число концов, способных к одновременной деполимеризации.
Связывание свободных тубулиновых субъединиц замедляет полимеризацию и увеличивает вероятность гидролиза ГТФ в субъединицах на конце каждого протофиламента.
Размеры структур, состоящих из микротрубочек, определяются совместным действием MAP,
которые оказывают стабилизирующее и дестабилизирующее действие.
При инактивации дестабилизаторов наступление катастрофы становится менее вероятным,
и это приводит к образованию структур, содержащих большое количество микротрубочек.
Инактивация стабилизаторов оказывает противоположное действие.
Поддержание необходимого баланса между противоположным эффектом компонентов позволяет контролировать размер структуры,
состоящей из микротрубочек, и при необходимости быстро менять его.
При болезни Альцгеймера, являющейся нейродегенеративным заболеванием,
один из MAP белков нейронов — tau, подвергается гиперфосфорилированию и образует агрегаты, состоящие из парных спирализованных филаментов.
Представлена микрофотография выделенных агрегатов, сделанная с помощью электронного микроскопа.
