• Микротрубочки постоянно переключаются с фазы роста на фазу укорачивания; этот процесс обозначается как динамическая нестабильность
• Переход от состояния роста к состоянию укорачивания называется катастрофой
• Переход от состояния укорачивания к состоянию роста называется спасением
• Популяция микротрубочек растет и укорачивается асинхронно; в любой момент времени большая их часть находится в стадии роста и меньшая часть — в стадии укорачивания
• Строение растущих и укорачивающихся концов микротрубочек различно: растущие концы имеют выступы протофиламентов, а укорачивающиеся характеризуются участками, отклоняющимися в сторону от оси микротрубочки
В экспериментах in vitro, предпринятых с целью выяснения динамики и кинетики полимеризации микротрубочек, вначале использовали такие методы, как светорассеяние. Этим методом можно было измерять лишь общее количество полимера, присутствующее в данный момент времени. В середине 1980-х гг. были разработаны методы иммунофлуоресценции и электронной микроскопии, которые позволяли измерять степень полимеризации тубулина. В отличие от светорассеяния, эти методы позволяли визуализировать отдельные микротрубочки. В дальнейшем, эти микротрубочки можно было сосчитать и измерить их длину. Результаты этих экспериментов оказались совершенно неожиданными и помогли ответить на вопрос, почему обмен субъединиц тубулина в полимере происходит с большей скоростью, чем это можно предполагать на основании представления об установлении равновесия.
Если бы микротрубочки относились к равновесным полимерам, то в состоянии равновесия они бы обнаруживали лишь незначительные изменения длины, и их общее количество со временем существенно бы не менялось. Однако, используя новые методы, удалось показать, что в состоянии равновесия изменяются как длина, так и количество микротрубочек. В продолжении примерно 40 мин некоторые микротрубочки становятся в десять раз длиннее, в то время как общее их количество снижается. В дополнительных экспериментах по исследованию микротрубочек, образующихся на центросоме, также получились неожиданные результаты. Вначале микротрубочки полимеризовали на центросоме, а затем пробу разбавляли до концентрации тубулина ниже критической. В случае равновесного полимера все микротрубочки должны были бы сразу же начать разбираться, и этот процесс продолжался бы до повторного установления критической концентрации.
Однако, хотя некоторые микротрубочки, действительно, диссоциировали, остальные продолжали полимеризацию, т. е. полученный результат оказался несовместимым с представлением о равновесном полимере. Эти, а также другие результаты позволили предложить модель полимеризации микротрубочек в ходе процесса, который получил название динамическая нестабильность. При этом процессе микротрубочки постоянно находятся либо в фазе роста, либо укорачивания, и между этими фазами существуют резкие переходы. Эти переходы называются катастрофа, если происходит переключение от роста к укорачиванию, и спасение, если укорачивание сменяется ростом.
Одиночная микротрубочка растет от стабильного сайта нуклеации in vitro.
Минус-конец присоединен к нуклеирующей структуре, а плюс-конец свободен.
Рост микротрубочки регистрируется во времени с помощью микровидеосъемки. Процесс также представлен графически.
Вначале микротрубочка растет, затем начинает резко укорачиваться. После достижения минимальной длины она начинает расти снова.
Вскоре после этого происходит вторая катастрофа, и микротрубочка полностью разбирается.
Отметим, что разборка происходит в несколько раз быстрее, чем рост. Сверху каждой видео рамки обозначено время в сек.
Модель динамической нестабильности была подтверждена исследованиями с использованием метода световой микроскопии при наблюдении роста и укорачивания индивидуальных микротрубочек. На рисунке ниже представлен такой эксперимент. В этих экспериментах было показано, что индивидуальная микротрубочка дорастает до длины несколько микрон, после чего наступает катастрофа и трубочка быстро укорачивается. Может наступить спасение, в результате чего микротрубочка возобновит рост, или она может полностью диссоциировать. На рисунке ниже представлены два фрагмента видеозаписи микротрубочек, находящихся в фазе перехода между ростом и диссоциацией. Показаны две микротрубочки, которые предварительно получили из стабильной структуры (короткого фрагмента аксонемы жгутика — органеллы, состоящей из стабильных микротрубочек), одна растет на плюс-конце, а другая на минус-конце.
Эти эксперименты показывают, что плюс концы микротрубочек растут быстрее, чем минус. Также на плюс-концах чаще происходит катастрофа, что делает их более динамичными по сравнению с минус концами.
Существенным признаком динамической нестабильности микротрубочек является преимущественное состояние их элонгации или диссоциации, иногда прерываемое переходами между ними. Поскольку катастрофы и спасения наступают через произвольные интервалы времени, поведение отдельных микротрубочек в группе носит гетерогенную и асинхронную природу. Большинство микротрубочек будут расти медленно, но в то же время некоторые будут расти быстро. Отдельные микротрубочки не достигают равновесной длины; а каждая из них обычно становится длиннее или короче.
Структура концов растущих и диссоциирующих микротрубочек различна. Концы микротрубочек при полимеризации часто образуют листообразные выступы за счет того, что некоторые протофиламенты оказываются длиннее других. Субъединицы добавляются только к концам протофиламентов. По мере элонгации каждого протофиламента, субъединицы образуют боковые связи с соседними, и в конце концов выступы превращаются в структуру микротрубочки. При деполимеризации микротрубочки, концы отдельных протофиламентов закручиваются в кольца, внутренней стороной наружу. Субъединицы в отдельном, частично деструктурированном протофиламенте держатся вместе только за счет продольных связей.
Как обсуждалось в отдельных статьях на сайте, связи между субъединицами в пределах одного протофиламента нарушаются с одинаковой вероятностью, приводя к быстрой деградации протофиламентов за счет диссоциации концевых субъединиц и образование разломов в других местах.
В качестве стабильного сайта нуклеации при сборке очищенного тубулина in vitro использовали небольшой участок аксонемы жгутика.
Показаны два видео кадра. На верхнем кадре микротрубочка полимеризуется на каждом конце аксонемы.
У микротрубочки слева свободен плюс-конец; у микротрубочки справа — минус-конец.
За время между съемкой верхнего и нижнего кадров левая микротрубочка диссоциировала полностью; микротрубочка справа диссоциировала частично, и затем снова начала рост.
Сверху представлены микрофотографии плюс-концов растущих и диссоциирующих микротрубочек, сделанные в электронном микроскопе.
С одной стороны конца растущей микротрубочки выходят длинные протофиламенты.
Эти протофиламенты расположены на плоской поверхности, к которой были присоединены микротрубочки при приготовлении препарата.
Поэтому на конце протофиламенты видны расположенными в плоскости. На диссоциирующем конце протофиламенты отсоединяются от стенки микротрубочки и закручиваются в обратную сторону.
