• Кинетохоры связывают микротрубочки посредством механизма поиска-захвата. Этот механизм использует динамическую нестабильность микротрубочек. Механизм поиска-захвата обеспечивает процессу сборки веретена большую гибкость
• Захват микротрубочки приводит к движению кинетохора по направлению к полюсу. Это способствует захвату дополнительных микротрубочек и служит началом формирования пучка кинетохорных микротрубочек
• Обычно один из сестринских кинетохоров захватывает микротрубочку и формирует нить раньше другого
• Для образования нити существенной является способность кинетохора стабилизировать ассоциированные микротрубочки
• Кинетохоры, находящиеся в натянутом состоянии, гораздо более эффективно стабилизируют микротрубочки, чем свободные кинетохоры
Для прикрепления хромосомы к веретену необходимо, чтобы каждый ее кинетохор прикрепился к микротрубочке от одной из двух центросом. Каким образом микротрубочки звездчатых структур и кинетохоры находят друг друга? Этот вопрос представляет для клетки существенную пространственную проблему, которая должна быть решена с максимальной точностью. Хромосомы очень велики, и скорость их спонтанного перемещения крайне низка.
Таким образом, за счет движения кинетохора решить ее невозможно. Поэтому существует неподвижная мишень, которую должны найти микротрубочки. При этом на одной чаше весов оказывается точность сегрегации хромосом, а на другой размер кинетохоров, который крайне мал, плюс необходимость того, что все 92 кинетохора (в случае клеток человека) должны найти микротрубочки и присоединиться к ним. Ситуация осложняется еще и тем, что, когда начинается митоз, локализация кинетохоров является совершенно непредсказуемой.
После разрушения оболочки ядра хромосомы распределяются по цитоплазме, причем их положение и ориентация от клетки к клетке и от деления к делению являются различными. Веретено должно сформироваться правильно, вне зависимости от того, как располагаются хромосомы. Очевидно, что механизм, позволяющий найти микротрубочки и присоединить их к кинетохорам, должен отличаться крайней гибкостью и исключительной надежностью.
Все эти проблемы решаются за счет динамических свойств, которыми обладают микротрубочки веретена. Вскоре после начала митоза две центросомы модифицируются таким образом, что они приобретают способность нуклеировать гораздо больше микротрубочек, чем в интерфазе. Примерно в это же время микротрубочки становятся более динамичными. Катастрофы становятся более частыми, а укорачивающиеся микротрубочки спасаются в редких случаях и чаще разрушаются.
Наступившие изменения создают такое положение, при котором большое количество микротрубочек постоянно полимеризуется в произвольном направлении от каждой из двух центросом, а затем, если они не были стабилизированы, разрушается и полностью исчезает. Потерянные микротрубочки замещаются другими, растущими в других направлениях. Такой динамичный поиск микротрубочек, незадолго до наступления процесса сборки веретена, показан на видеофрагменте. В результате после разрушения ядерной оболочки все содержимое клетки постоянно зондируется растущими концами микротрубочек.
Первый кадр видеосъемки, показывающий живую клетку организма птицы, экспрессирующую белок ЕВ1, который содержит флуоресцентный зонд.
Белок связывается с растущим концом микротрубочки. Каждая белая точка представляет собой растущий конец микротрубочки.
Ядро видно как слегка затемненная область, расположенная между двумя центромерами и немного левее.
В этих условиях вопрос встречи астральных микротрубочек с каждым кинетохором составляет вопрос времени. Этот механизм поиска-захвата обеспечивает прикрепление всех кинетохоров к микротрубочкам и позволяет образоваться веретену независимо от положения и ориентации хромосом в начале митоза.
Когда растущая микротрубочка встречает кинетохор, ее захватывают белковые моторы, находящиеся в короне. В одних случаях кинетохор прикрепляется к стенке микротрубочки, в других — непосредственно прикрепляется к ее плюс-концу. В любом случае кинетохор немедленно начинает быстро двигаться вдоль микротрубочки по направлению к полюсу. В результате, в том же направлении за кинетохором транспортируется хромосома. В определенный момент времени, кинетохор, который вначале был прикреплен к боковой стороне микротрубочки, присоединяется к плюс-концу другой микротрубочки звездчатой структуры.
Движение кинетохора в направлении полюса при его прикреплении к веретену ориентировано таким образом, что он обращен к полюсу передней стороной. Продолжая такое движение к полюсу, кинетохор захватывает больше микротрубочек, начиная процесс формирования нити кинетохора. Поскольку, когда происходит захват новых трубочек, кинетохор обращен к полюсу, большинство их прикрепляются своими концами к пластинке кинетохора и прекращают свой рост. Процесс постепенного образования нити кинетохора в раннем митозе, показан на рисунке ниже.
Из-за случайного характера механизма поиска-захвата сестринские кинетохоры редко одновременно прикрепляются к образующемуся веретену. После прикрепления первого кинетохора хромосома становится моноориентированной. Другой кинетохор остается свободным до тех пор, пока он не захватит микротрубочку, растущую от дальнего полюса. Когда это произошло, хромосома становится биориентированной. и формируется нить кинетохора, соединяющая хромосому с этим полюсом. Ориентирование в двух направлениях представляет собой единственный вид ориентации, который гарантирует, что в анафазе две хроматиды реплицированной хромосомы разойдутся к противоположным полюсам.
Когда хромосома ориентирована в двух направлениях, она начинает двигаться по направлению к середине веретена. При этом два кинетохора функционируют по-разному: один должен двигаться к тому полюсу, к которому он прикреплен, укорачивая нить кинетохора, в то время как другой — от полюса с удлинением нити. Поскольку ориентация в двух направлениях существенна для контроля точности распределения хромосом, в клеточном цикле существует контрольная точка, проверяющая правильность прикрепления сестринских кинетохоров.
Кинетохоры меняют свойства микротрубочек, к которым они прикрепляются. Эта первичная ассоциация хромосомы с микротрубочкой существенно влияет на тип ее связи с полностью сформированным митотическим веретеном. Наиболее важное проявление эффекта взаимодействия микротрубочки с прикрепленным кинетохором заключается в увеличении продолжительности ее существования. Полупериод существования микротрубочек, связанных с кинетохором, составляет около пяти минут, в то время как для остальных микротрубочек веретена он обычно составляет менее одной минуты. Увеличение стабильности приводит к накоплению микротрубочек с кинетохорами и к формированию кинетохорных пучков.
Однако микротрубочки проявляют свою динамичную природу даже в составе кинетохоровых пучков. Так, иногда от кинетохора отделяются и теряются отдельные микротрубочки, и в то же время прикрепляются новые.
Количество микротрубочек, которые в конечном счете способны прикрепиться к кинетохору, зависит от величины кинетохора и от соотношения между скоростью прикрепления микротрубочки и ее динамики. Чем больше кинетохор, тем к большему количеству микротрубочек он способен прикрепиться. У клеток высших животных кинетохоры обычно способны связывать от 20 до 40 микротрубочек, однако нити кинетохора могут содержать их меньше из-за постоянно происходящих процессов диссоциации и реассоциации микротрубочек.
Что определяет диссоциацию микротрубочек от кинетохора? Существуют убедительные доказательства, что это отчасти связано со степенью натяжения, существующего между кинетохором и связанной с ним центромерой. Например, если при образовании веретена, для продвижения центромеры хромосомы, ориентированной в двух направлениях, к одному из полюсов используется тонкая игла, то количество микротрубочек, прикрепленных к кинетохору и направленных к этому полюсу, увеличивается. Очевидно, что натяжение каким-то образом способствует стабилизации (и, таким образом, накоплению) микротрубочек на кинетохоре.
Смысл такого влияния натяжения заключается в том, что оно обеспечивает способ селективной стабилизации правильного прикрепления хромосомы к веретену: сестринские кинетохоры будут под максимальным натяжением — и их микротрубочки будут обладать максимальной стабильностью — когда они присоединены к противоположному полюсу и движутся к нему, т. е. когда они правильно ориентированы для успешного митоза.
Динамичные микротрубочки ищут кинетохоры по всей клетке.
При этом они растут и укорачиваются в различных направлениях от центросомы. Те, которые нашли кинетохор, захватываются им и стабилизируются.
Такой механизм поиска-захвата сборки веретена позоляет формировать его независимо от формы клетки или от положения хромосом в начале процесса.
Первый кадр видеосъемки, демонстрирующий присоединение кинетохора к микротрубочке и последующее движение хромосомы к полюсу.
Кадры видеосъемки, иллюстрирующие, каким образом микротрубочки присоединяются к хромосомам и образуют фибриллы веретена.
Последовательные кадры съемки клеток,
сделанной в световом микроскопе, показывающие разрушение ядерной оболочки и первый контакт хромосом с микроторубочками, растущими от полюсов.
Сразу после разрушения ядерной оболочки несколько хромосом располагаются у одного полюса таким образом,
что кинетохор ориентируется в направлении на него. Остальные хромосомы или остаются в свободном состоянии,
или уже оказываются прикрепившимися к обоим полюсам и продвинулись к середине веретена.
Иммунофлуоресцентная микрофотография клетки в прометафазе. Окрашивание.
Многие хромосомы уже прикрепились к обоим полюсам и переместились к центру веретена, однако некоторые — включая отмеченные стрелками — еще связаны только с одним полюсом.
Заметна их V-образная форма и близкое расположение к полюсам.
Фотография центромеры и кинетохоров моноориентированной хромосомы, сделанная в электронном микроскопе.
Хромосома такая же, как представленные на рисунках ниже.
Справа к кинетохору прикреплен пучок микротрубочек, расположенных параллельно; другой кинетохор свободен.
Кадры видеосъемки, показывающие захват микротрубочек моноориентированными хромосомами и их последующее перемещение к центру веретена.
