• При связывании ГТФ с субъединицей Ga происходит активация гетеротримеров G-белков • При гидролизе ГТФ до ГДФ G-белок инактивируется
• Гидролиз ГТФ происходит медленно, однако под действием белков GAP он ускоряется
• Рецепторы способствуют активации, обеспечивая диссоциацию ГДФ и ассоциацию ГТФ; спонтанный обмен происходит очень медленно
• Белки RGS и фосфолипаза С-β являются GAP для G-белков
Ключевым событием передачи сигнала с участием гетеротримера G-белков является связывание ГТФ с субъединицей Ga. При связывании с ГТФ субъединица Ga активируется, что обеспечивает связывание этой субъединицы и субъединицы Gβγ с эффектором и позволяет регулировать этот процесс.
Пока ГТФ находится в связанном состоянии, субъединица Ga остается активной, однако она также обладает ГТФазной активностью и гидролизует связанный ГТФ до ГДФ. Ga-ГДФ является неактивным. Таким образом, G-белки пересекают ГТФазный цикл в двух местах: на этапах «связывание ГТФ/активация» и «гидролиз ГТФ/инактивация». Поэтому для контроля передачи сигналов с участием G-белка характерен кинетический характер.
Относительная сила сигнала или его амплитуда пропорциональна доле G-белка, которая находится в активной, связанной с ГТФ форме. Ее размеры определяются равновесием между скоростью связывания ГТФ и его гидролиза, т. е. между активирующей и инактивирующей составляющими ГТФазного цикла. Скорости связывания и гидролиза ГТФ регулируются в широких пределах, которые могут различаться более чем в 1000 раз.
Рецепторы способствуют активации G-белка за счет открытия сайта связывания нуклеотидов, расположенного на его молекуле. При этом интенсифицируется диссоциация ГДФ и ассоциация ГТФ. Суммарно эти процессы обозначаются как каталитический обмен ГДФ/ГТФ. Обмен происходит в направлении активации, поскольку сродство G-белков к ГТФ гораздо выше, чем к ГДФ, и концентрация ГТФ в цитозоле примерно в 20 раз выше, чем концентрация ГДФ.
Для большинства G-белков спонтанный обмен ГДФ/ГТФ очень низкий (занимает много минут), и это обеспечивает низкий базальный уровень выходного сигнала. Напротив, обмен, катализируемый рецептором, занимает несколько десятков миллисекунд, что обусловливает быструю реакцию на сигнал зрительных рецепторов, нейронов и мышечных клеток.
Активация G-белков происходит при ассоциации ГТФ с субъединицей Ga, в результате чего Ga-ГТФ и Gβγ связываются с соответствующими эффекторными белками и регулируют их активность.
Субъединицы Ga также обладают внутренней ГТФазной активностью, и основной процесс, приводящий к инактивации, представляет собой гидролиз связанного ГТФ с образованием ГДФ (а не диссоциация ГТФ).
Таким образом, результирующий сигнал на выходе модуля рецептор-G-белок, определяется частью G-белка, находящегося в связанном с ГТФ состоянии.
Эта часть определяется балансом между скоростью активации и инактивации.
Связывание ГТФ и его гидролиз происходят медленно и подвержены тонкой регулировке.
ГДФ прочно связывается с Ga, и его диссоциация служит лимитирующим фактором связывания новой молеклуы ГТФ и последующей реактивации.
Высвобождение ГДФ и связывание ГТФ катализируются GPCR. Гидролиз связанного ГТФ ускоряется белками, активирующими ГТФазу (GAP).
Рецепторы и GAP осуществляют скоординированный контроль стационарного уровня выходного сигнала и скорости активации и инактивации модуля.
Поскольку рецепторы не требуются для реализации дальнейшей передачи сигнала G-белками, они могут диссоциировать после того, как произошел обмен ГДФ/ГТФ, и катализировать активацию дополнительных молекул G-белка. Таким образом, один рецептор может поддерживать активацию нескольких молекул G-белка, обеспечивая усиление входного сигнала на молекулярном уровне. Остальные рецепторы могут оставаться связанными со своими G-белками-мишенями, что означает, что они не действуют как усилители.
Однако более прочно связанные рецепторы могут быстрее инициировать передачу сигнала и способствовать реактивации G-белка, если гидролиз связанного ГТФ происходит жостаточно быстро.
В отсутствие подходящего стимула субъединицы Ga медленно гидролизуют ГТФ. Среднее время пребывания комплекса Ga-ГТФ, в зависимости от G-белка, составляет около 10-150 с. Это гораздо ниже, чем скорость инактивации, которая часто наблюдается в клетках при удалении агониста. Например, передача зрительных сигналов заканчивается примерно через 10 мс после стимуляции фотоном, и многие другие системы G-белков функционируют столь же быстро.
Гидролиз ГТФ активируется белком, активирующим ГТФазу (GAP), который непосредственно связывается с субъединицами Ga. В некоторых случаях реакция ускоряется более чем в 2000 раз. Столь высокая скорость необходима для функционирования зрительной системы и системы передачи нервного импульса, которые должны реагировать на быструю смену стимулов. Поскольку передача сигналов с участием G-белков определяется равновесием между активацией и инактивацией, GAP опустошает пул G-белка, активированного ГТФ, и поэтому может также действовать как ингибитор передачи сигнала.
Таким образом, GAP может ингибировать процессы передачи сигнала, гасить их после его окончания, или выполнять обе функции. Выполняемая функция зависит от активности GAP и ее регуляции.
Для G-белков, не обладающих гетеротримерной структурой, существуют два семейства GAP. Белки RGS (регуляторы передачи сигнала G-белками) представляют собой семейство, состоящее примерно из 30 белков, большинство из которых обладает активностью GAP и способно регулировать скорость и амплитуду передачи сигнала G-белками. Рисунок ниже иллюстрирует роль белков RGS в терминации сигнала, передаваемого через G-белки. Некоторые белки, имеющие RGS домен, также действуют как эффекторы, регулируемые G-белками.
К числу их относятся активаторы мономерных ГТФ-связывающих белков, относящиеся к семейству Rho и GPCR киназы, которые являются регуляторами функции GPCR по механизму обратной связи. Ко второй группе GAP G-белков относятся фосфолипазы С-β. Эти ферменты представляют собой эффекторы, которые стимулируются Gαq и Gβγ, однако они также действуют как Gq GAP, по-видимому, контролируя кинетику выходного сигнала.
Хотя ГТФазный цикл в общем воде наглядно представлен на рисунке ниже, схема содержит много упрощений. Взаимодействия между рецептором, Ga, Gβγ, GAP и эффектором часто происходят одновременно и носят сложный кооперативный характер. Например, Gβγ ингибирует высвобождение ГДФ (с тем, чтобы свести к минимуму спонтанную активацию), способствует проявлению каталитической активности рецептора, подавляет активность GAP и участвует в инициации фосфорилирования рецептора, которое приводит к десенсибилизации.
Остальные компоненты могут проявлять такую же многофункциональность. Вместе с тем, входные сигналы от других белков могут изменять динамику ГТФазного цикла в нескольких точках. Таким образом, модуль коровых G-белков является многофункциональным процессором сигнала, а также проявляет гибкость в отношении своих мишеней.
GAP G-белка могут приближать наступление момента окончания сигнала после удаления агониста,
и часто при выработке рецептором ответа не проявляют себя как ингибиторы.
На рисунке представлен характер ответного электрического сигнала фоторецепторной клетки (палочки) мыши на световой фотон.
У животных, дефектных по RGS9, который представляет собой GAP для фоторецепторного G-белка Gt, сигнал длится в продолжение многих секунд.
Это объясняется тем, что гидролиз ГТФ, связанного с Gt, происходит медленно.
У гетерозиготных мышей дикого типа гидролиз завершается примерно за 15 мс, и продолжительность сигнала гораздо короче.
Заметьте, что величина макисмального выхода у мутантов и мышей дикого типа одинакова, что указывает на то, что в палочках GAP не является ингибитором.
У человека генетический дефект по RGS9 приводит к тяжелому расстройству зрения, которое особенно проявляется при ярком свете.
