Метод восстановления флуоресценции после обесцвечивания - FRAP
• С помощью высокоинтенсивного лазерного излучения можно полностью удалить флуоресценцию зонда в белках или липидах
• Восстановление флуоресценции в обесцвеченной области происходит по мере заполнения ее мечеными белками или липидами. Они встраиваются на место обесцвеченных метаболитов
• Восстановление в микротрубочках участков после фотообесцвечивания требует их разборки и новой полимеризации, включающей флуоресцирующие тубулиновые димеры
Метод восстановления флуоресценции после обесцвечивания (FRAP) используется для измерения скорости, с которой конкретная молекула или структура обменивается с другими такими же молекулами и структурами, находящимися в небольшой области клетки.
В случае отдельных молекул (обычно липидов или белков, не входящих в крупные структуры) FRAP позволяет выяснить, насколько быстро диффундируют молекулы и какая их часть обладает подвижностью. Для белков, которые служат компонентами крупных неподвижных структур (например, филаментов цитоскелета), можно определить, как часто эти структуры диссоциируют и собираются повторно.
Для того чтобы воспользоваться методом FRAP, вначале в клетку необходимо ввести белок или липид, содержащий флуоресцентную метку. За клеткой наблюдают во флуоресцентном микроскопе и выжигают флуоресценцию в интересующей области при облучении ее лазерным пучком. (Удаление флуоресценции зонда высокоинтенсивным лазерным излучением называется обесцвечивание, отсюда и термин — фотоообесцвечивание.)
При этом пропадает только флуоресценция зонда, белок или липид сохраняют функциональную активность (так же как и структура, частью которой они являются), однако становятся невидимыми во флуоресцентном микроскопе. Если молекула с обесцвеченной флуоресцентной меткой способна к диффузии или к сборке в обесцвеченной зоне, то флуоресценция восстанавливается.
При изучении микротрубочек в клетку вводят тубулины, содержащие флуоресцентный зонд, и в продолжение определенного времени дают им возможность равномерно включиться в состав всех микротрубочек. Зонд представляет собой либо небольшую флуоресцирующую молекулу, ковалентно связанную с очищенным тубулином, либо фьюжн-белок, состоящий из а-тубулина и зеленого флуоресцирующего белка.
Как видно на рисунке ниже, после удаления флуоресценции в определенной области ее восстановление требует деполимеризации микротрубочек и сборки новых, которые включают тубулин с интактным флуоресцирующим зондом. Таким образом, скорость восстановления флуоресценции пропорциональна скорости оборота субъединиц микротрубочек.
Зелеными линиями представлены отдельные микротрубочки, состоящие из субъединиц, которые содержат флуоресцентный зонд.
Перед началом эксперимента в небольшой области производят обесцвечивание флуоресцентного зонда, освещая ее высокоинтенсивным излучением.
Если микротрубочки не проявляют динамических свойств, область неопределенно долго остается обесцвеченной.
При проявлении ими динамических свойств, как показано на рисунке, в обесцвеченной области наблюдается постепенное восстановление флуоресценции.
Это происходит по мере того, как обесцвеченные микротрубочки деполимеризуются и замещаются новыми, которые образуются при полимеризации субъединиц, содержащих флуоресцентный зонд.
Поскольку количество обесцвеченных субъединиц в клетке невелико по сравнению с общим их пулом, вновь образованные микротрубочки флуоресцируют равномерно по всей длине.
Таким образом, скорость восстановления флуоресценции в выбранной области отражает степень проявления миткротрубочками динамических свойств.