МедУнивер - MedUniver.com Все разделы сайта Видео по медицине Книги по медицине Форум консультаций врачей  
Рекомендуем:
Генетика:
Генетика
Аномалии хромосом
Биология клетки
Генетика врожденных пороков
Генетика рака - опухолей
Молекулярная генетика
Наследственные синдромы
Цитогенетика - исследование хромосом
Лечение наследственных болезней
Фармакогенетика
Форум
 

Метод восстановления флуоресценции после обесцвечивания - FRAP

• С помощью высокоинтенсивного лазерного излучения можно полностью удалить флуоресценцию зонда в белках или липидах

• Восстановление флуоресценции в обесцвеченной области происходит по мере заполнения ее мечеными белками или липидами. Они встраиваются на место обесцвеченных метаболитов

• Восстановление в микротрубочках участков после фотообесцвечивания требует их разборки и новой полимеризации, включающей флуоресцирующие тубулиновые димеры

Метод восстановления флуоресценции после обесцвечивания (FRAP) используется для измерения скорости, с которой конкретная молекула или структура обменивается с другими такими же молекулами и структурами, находящимися в небольшой области клетки.

В случае отдельных молекул (обычно липидов или белков, не входящих в крупные структуры) FRAP позволяет выяснить, насколько быстро диффундируют молекулы и какая их часть обладает подвижностью. Для белков, которые служат компонентами крупных неподвижных структур (например, филаментов цитоскелета), можно определить, как часто эти структуры диссоциируют и собираются повторно.

Для того чтобы воспользоваться методом FRAP, вначале в клетку необходимо ввести белок или липид, содержащий флуоресцентную метку. За клеткой наблюдают во флуоресцентном микроскопе и выжигают флуоресценцию в интересующей области при облучении ее лазерным пучком. (Удаление флуоресценции зонда высокоинтенсивным лазерным излучением называется обесцвечивание, отсюда и термин — фотоообесцвечивание.)

При этом пропадает только флуоресценция зонда, белок или липид сохраняют функциональную активность (так же как и структура, частью которой они являются), однако становятся невидимыми во флуоресцентном микроскопе. Если молекула с обесцвеченной флуоресцентной меткой способна к диффузии или к сборке в обесцвеченной зоне, то флуоресценция восстанавливается.

При изучении микротрубочек в клетку вводят тубулины, содержащие флуоресцентный зонд, и в продолжение определенного времени дают им возможность равномерно включиться в состав всех микротрубочек. Зонд представляет собой либо небольшую флуоресцирующую молекулу, ковалентно связанную с очищенным тубулином, либо фьюжн-белок, состоящий из а-тубулина и зеленого флуоресцирующего белка.

Как видно на рисунке ниже, после удаления флуоресценции в определенной области ее восстановление требует деполимеризации микротрубочек и сборки новых, которые включают тубулин с интактным флуоресцирующим зондом. Таким образом, скорость восстановления флуоресценции пропорциональна скорости оборота субъединиц микротрубочек.

Метод восстановления флуоресценции после обесцвечивания - FRAP
Зелеными линиями представлены отдельные микротрубочки, состоящие из субъединиц, которые содержат флуоресцентный зонд.
Перед началом эксперимента в небольшой области производят обесцвечивание флуоресцентного зонда, освещая ее высокоинтенсивным излучением.
Если микротрубочки не проявляют динамических свойств, область неопределенно долго остается обесцвеченной.
При проявлении ими динамических свойств, как показано на рисунке, в обесцвеченной области наблюдается постепенное восстановление флуоресценции.
Это происходит по мере того, как обесцвеченные микротрубочки деполимеризуются и замещаются новыми, которые образуются при полимеризации субъединиц, содержащих флуоресцентный зонд.
Поскольку количество обесцвеченных субъединиц в клетке невелико по сравнению с общим их пулом, вновь образованные микротрубочки флуоресцируют равномерно по всей длине.
Таким образом, скорость восстановления флуоресценции в выбранной области отражает степень проявления миткротрубочками динамических свойств.

Редактор: Искандер Милевски. Дата обновления публикации: 18.3.2021

- Также рекомендуем "Механизм синтеза и модификации тубулина"

Оглавление темы "Микротрубочки клетки":
  1. Механизм ассиметрии клетки через динамику микротрубочек и моторов
  2. Взаимодействие микротрубочек и актиновых филаментов клетки
  3. Строение ресничек и жгутиков клетки
  4. Перспективы изучения микротрубочек
  5. Значение гидролиза ГТФ тубулином микротрубочек
  6. Метод восстановления флуоресценции после обесцвечивания - FRAP
  7. Механизм синтеза и модификации тубулина
  8. Методы изучения подвижности моторных белков микротрубочек
  9. Актиновые филаменты и актиновый цитоскелет клетки
  10. Актин в составе цитоскелета клетки
Медунивер Мы в Telegram Мы в YouTube Мы в VK Форум консультаций врачей Контакты, реклама
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.