Методы изучения подвижности моторных белков микротрубочек
• Моторные белки сохраняют активность в клеточных экстрактах. Это позволяет выделять их в очищенном виде
• Моторные белки прикрепляются к стеклу и обеспечивают скольжение микротрубочек по поверхности
• Бусины — шарики, покрытые моторными белками, способны транспортироваться по микротрубочкам
• Используя микротрубочки с обозначенной полярностью, можно определить, в каком направлении движется по ним мотор
Открытие и выделение моторных белков микротрубочек были связаны с разработкой новых методов, которые позволили исследователям изучать их подвижность в экстрактах клеток in vitro или используя очищенные препараты белковых моторов. К открытию кинезина привели наблюдения над движущимися везикулами в грубом экстракте клеток — по существу неразбавленной цитоплазме — приготовленном из одного гигантского аксона кальмара.
Аксон представляет собой перспективный объект для поиска таких молекулярных моторов, поскольку по его микротрубочкам осуществляется интенсивное движение везикул. Гигантский аксон отделяли от тела кальмара, и из него выдавливали цитоплазму (или аксоплазму, как ее предпочитают называть нейробиологи), которую для наблюдения движения помещали на предметное стекло. Путем фракционирования аксоплазмы и исследования подвижности каждой фракции Рон Вейл с сотр. выделили первый кинезиновый мотор.
В отличие от традиционных биохимических исследований, которые выполняются в пробирках, подвижность исследуется под микроскопом, что позволяет проследить за движением, которое обеспечивается мотором. Каким образом под микроскопом можно наблюдать активность мотора? Чтобы обнаружить движение, необходимо следить за объектом во времени. При этом белки должны быть нативными. При применении электронной микроскопии это исключается.
Последняя требует жесткой химической обработки образцов, которая инактивируют белки. Световая микроскопия не обладает столь высоким разрешением как электроннная, но обладает тем преимуществом, что обычно требует менее жесткой обработки образцов или вообще ее не требует. Поэтому ее можно использовать для изучения процессов требующих активных белков и которые продолжаются несколько минут или дольше. Однако микротрубочки слишком малы, чтобы связанную с ними подвижность можно было наблюдать с помощью обычного светового микроскопа.
Изображение микротрубочки, полученное с помощью DIC-микроскопии с последующим компьютерным усилением.
Изображение выглядит зернистым, однако отчетливо видно положение микротрубочки и ее длина.
С помощью этого метода можно измерять длину микротрубочек, наблюдать подвижность и транспортные процессы с их участием.
Проблема решается при визуализации микротрубочек одним из двух способов. Один способ состоит в использовании дифференциальной интерференционно-контрастной микроскопии (DIC) (являющейся разновидностью световой микроскопии) и в улучшении видимости с помощью видео и компьютерных методов. На рисунке ниже показана микротрубочка, которая наблюдалась с применением метода DIC. Другой способ состоит в предварительной сборке микротрубочек из димеров тубулина, меченных флуоресцентным зондом, и дальнейшем наблюдением за ними с помощью флуоресцентного микроскопа.
Интересно, что для исследования подвижности белковых моторов карго не требуется. Это объясняется тем, что, в отличие от микротрубочек, белковые моторы связываются со стеклянными поверхностями (предметное и покровное стекло микроскопа). При связывании со стеклом только моторов, их активность позволяет микротрубочкам перемещаться по поверхности. Соответствующие примеры представлены на рисунках ниже.
Тест перемещения микротрубочек был использован для исследования биохимических фракций, которые получались при очистке первого кинезина. Этот тест обычно применяется для исследования моторных белков микротрубочек. В одной из его модификаций используют стеклянные или латексные бусинки, покрытые белковыми моторами, и наблюдают их движение по микротрубочкам.
Такая «бусиночная проба» несколько более сложна, поскольку за бусинками и микротрубочками необходимо наблюдать с помощью светового микроскопа. Во всех случаях микротрубочки вначале стабилизируют, путем их связывания с паклитакселем.
Характерная особенность белковых моторов состоит в том, что они способны перемещаться вдоль микротрубочки только в одном направлении. Для того чтобы определить, движется ли мотор по направлению к плюс- или минус-концу, необходимо высянить, каким образом определяется полярность микротрубочки. Один из способов, позволяющих определить полярность, вначале включает сборку радиальных структур микротрубочек на изолированных центросомах, а затем их фиксацию на предметном стекле. Затем на это стекло наносят бусинки и наблюдают их движение.
При этом бусинки, покрытые белковым мотором, которые движутся к центру структуры, движутся к минус-концу, а те, которые движутся от центра, движутся к плюс-концу. Еще один способ пометить полярность микротрубочек основан на более быстрой полимеризации плюс-конца. Для выполнения теста вначале формируют короткие микротрубочки с очень высоким процентом субъединиц, содержащих флуоресцирующий зонд. Эти ярко светящиеся микротрубочки затем используются как центры нуклеации более длинных микриотрубочек в растворе, содержащем гораздо более низкий процент флуоресцирующего тубулина.
Молекулы тубулина добавляются к обоим концам трубочек-центров нуклеации, но гораздо быстрее к плюс-концу. В результате образуется набор микротрубочек с одним коротким и очень ярким участком в середине, и более тусклыми, но видимыми участками на концах. Участок с плюс-конца горазо длиннее, чем с минус-конца, что сразу же позволяет определить полярность микротрубочки. Эти флуоресцирующие микротрубочки с обозначенной полярностью можно использовать для определения подвижности с целью определить направление движения. При расшифровке результатов эксперимента важно помнить, что белковые моторы зафиксированы.
При движении мотора в направлении плюс-конца микротрубочка будет продвигаться вперед своим минус-концом. Почти все методы определения подвижности представляют собой варианты этих тестов. Характер поставленных задач, детали экспериментальных приспособлений и разрешение системы детекции могут различаться, но основной принцип остается тем же самым.
Серия видеокадров, показывающих микротрубочку, которая перемещается по поверхности стекла.
Изображение получено в эксперименте in vitro.
Микротрубочки визуализированы методом дифференциальной интерференционной микроскопии (DIC) с последующей обработкой изображения.
Транспорт микротрубочек происходит за счет генерации усилий белковыми моторами, связанными с поверхностью стекла.
Два видеокадра, показывающие перемещение двух микротрубочек по поверхности стекла.
Микротрубочки собраны из очищенного тубулина, к которому добавлено немного тубулина, содержащего флуоресцентный зонд.
Кинезин прикрепляется к стеклу потому, что положительный заряд его хвостового домена взаимодействует с отрицательно заряженной поверхностью стекла.
Красной и желтой стрелками отмечено положение двух микротрубочек; направление их движения обозначено пунктирными линиями.
Одиночная микротрубочка, сформировавшаяся из небольшого предшественника,
на плюс-конце которого содержится значительно большее количество тубулиновых субъединиц с флуоресцирующим зондом.
Хорошо заметна разница по длине между плюс- и минус-концами. Такие микротрубочки позволяют легко определять направление движения моторов.
