• В зависимости от доступности для микрококковой нуклеазы ДНК нуклеосом делится на коровую и линкерную
• Длина коровой ДНК составляет 146 пн, и она расположена на коровых частицах, которые образуются при продолжительном переваривании хроматина микрококковой нуклеазой
• Линкерная ДНК в длину имеет 8-114 пн, и характеризуется повышенной чувствительностью к нуклеазе
• Изменения в общей длине нуклеосомной ДНК определяются изменениями длины линкерной ДНК
• Гистон Н1 связан с линкерной ДНК и, вероятно, локализован в точке входа ДНК в нуклеосому и выхода из нее
В составе нуклеосом из разных источников находится ДНК различной длины. Однако для них характерна общая основная структура. При связывании ДНК с октамером гистонов образуется коровая частица, содержащая 146 пн ДНК, независимо от общей длины ДНК, входящей в нуклеосому. Вариабельность обшей длины нуклеосомной ДНК накладывается на эту основную структуру.
Коровая частица была идентифицирована по действию нуклеазы микрококков на нуклеосомный мономер. Вначале фермент образует разрывы в ДНК, расположенной между нуклеосомами. Однако если продолжить реакцию после того, как образовались мономеры, то расщепление захватывает часть ДНК самой нуклеосомы. Эта реакция протекает путем «подрезания» ДНК с концов нуклеосомы.
Как показано на рисунке ниже, длина ДНК уменьшается ступенчато. Например, в ядрах печени крысы нуклеосомные мономеры сначала содержат отрезок ДНК длиной в 205 пн. Потом обнаруживаются мономеры, у которых длина ДНК снижена до 165 пн. Наконец, длина этих мономеров сокращается до размера ДНК в коровой частице, 146 пн. (Эта частица достаточно устойчива, однако если продолжать обработку ферментом, то образуется «ограниченный перевар», содержащий фрагменты, самые длинные из которых соответствуют 146 пн коровой ДНК, а самые короткие достигают 20 пн.)
На основании такого анализа можно разделить нуклеосомную ДНК на две части:
• Коровая ДНК имеет постоянную длину 146 пн и относительно устойчива к расщеплению нуклеазами.
• Линкерная ДНК включает остаток повторяющейся единицы. Ее длина варьирует от такого малого размера, как 8 пн, до такого большого, как 114 пн на одну нуклеосому.
Четко ограниченный размер полосы ДНК, образующейся в результате начального этапа расщепления нуклеазой, говорит о том, что область, непосредственно доступная для действия фермента, ограничена. В нее входит только часть каждого линкера. (Если бы вся линкерная часть была чувствительна, то размер полосы находился бы в интервале от 146 пн до > 200 пн.) Однако после того, как в линкерной ДНК образовался разрыв, оставшаяся часть ДНК становится чувствительной и довольно быстро расщепляется ферментом. На рисунке ниже представлены этапы расщепления ДНК нуклеосом микрококковой нуклеазой.
Коровые частицы обладают близкими к нуклеосомам свойствами, однако по размеру они меньше. Тем не менее по форме они напоминают нуклеосомы. Это позволяет считать, что основная структура нуклеосомы определяется взаимодействием между ДНК и белковым октамером коровой частицы. Поскольку коровые частицы легче получить в виде гомогенных препаратов, они чаще используются для структурных исследований, чем нуклеосомы. (Нуклеосомы варьируют по размеру, поскольку трудно получить препарат, в котором концы ДНК не были бы подрезаны.)
Какую физическую природу имеют коровая и линкерные области? Эти названия были предложены в качестве рабочих для описания областей нуклеосом, обладающих различной чувствительностью к обработке нуклеазой, и не имеют отношения к их действительной структуре. Тем не менее основная часть коровой ДНК плотно накручена на нуклеосому, а терминальные участки коровой и линкерной областей более релаксированы.
Существование линкерной ДНК зависит от факторов, не связанных с четырьмя коровыми гистонами. Эксперименты по реконструкции нуклеосом in vitro показывают, что гистоны обладают характерной способностью к организации ДНК в коровых частицах, но не образуют нуклеосомы с присущими им парамерами. Важную роль играет степень суперспирализации ДНК. Гистон Н1 и/или негистоновые белки влияют на длину линкерной ДНК, связанной с октамерами гистонов в серии нуклеосом. В сборке нуклеосом из гистонов и ДНК in vivo участвуют «сборочные белки», которые не являются частью структуры нуклеосом.
Где локализуется гистон Н1? Этот гистон теряется при деградации мономеров нуклеосом. Он еще сохраняется в мономерах, включающих 165 пн ДНК, но всегда отсутствует в 146 пн коровых частицах. Это позволяет предполагать, что Н1 локализуется в области, где линкерная ДНК непосредственно примыкает к коровой.
Если гистон Н1 локализован в линкерной области, он может «запечатывать» ДНК в нуклеосоме, связываясь в точке, где ДНК входит в нуклеосому и выходит из нее. Представление о том, что гистон Н1 находится в межнуклеосомной области, согласуется с давно известными результатами о быстром удалении гистона Н1 из хроматина и столь же быстрой после этого «солюбилизации» хроматина. Также после удаления гистона Н1 легче получается фибрилла, содержащая бусинки на нитке.
Микрококковая нуклеаза дискретным образом снижает размеры ДНК в пределах мономеров нуклеосом.
Вначале микрококковая нуклеаза образует разрывы между нуклеосомами.
Обычно мононуклеосомы содержат 200 пн ДНК.
После подрезания концов длина ДНК сокращается вначале до 165 пн, а затем образуются коровые частицы, содержащие 146 пн.