• COPII везикулы представляют собой единственный тип транспортных везикул, которые происходят из эндоплазматического ретикулума
• Для сборки COPII окаймляющих белков на экспортных сайтах в эндоплазматическом ретикулуме необходима ГТФаза и структурные белки
• Сигналы для экспорта мембранных белков эндоплазматического ретикулума обычно находятся в их цитоплазматическом участке
• После отшнуровывания COPII везикулы образуют кластеры, сливаются и мигрируют по микротрубочкам в цис-участок аппарата Гольджи
В ЭПР происходит синтез и структурирование секреторных и других белков, предназначенных для различных компартментов экзо- и эндоцитоза. Белок выходит из ЭПР после того, как сформировалась его нативная структура, а в случае белковых комплексов, состоящих из субъединиц, только после их окончательной сборки. Белки, предназначенные на экспорт, собираются на сайтах ЭПР, в которых образуются везикулы, транспортирующие вновь синтезированные белки в аппарат Гольджи.
(В секреторных клетках экспортные сайты ЭПР определяются как сайты, в которых происходит интенсивный процесс отшнуровывания везикул, которые называются «переходные элементы».)
Транспортные везикулы называются везикулы COPII (англ, coat protein — белок окаймления, СОР). Они представляют собой единственный путь везикулярного экспорта материалов из ЭПР. Компоненты COPII способствуют выпячиванию мембраны, необходимому для образования везикулы, и могут взаимодействовать специфически с некоторыми трансмембранными карго-белками для их отбора на экспорт. Основные закономерности образования везикул COPII такие же, как и для других окаймленных везикул.
Процесс образования везикулы COPII представлен на рисунке ниже. Образование везикулы начинается с последовательного отбора растворимых цитозольных компонентов COPII, Sar1p, Sec23/Sec24 и See13/31. Sar1p представляет собой небольшую ГТФазу, которая находится в цитозоле в неактивной, связанной с ГДФ форме. Она связывается с мембранами ЭПР, взаимодействуя с фактором обмена гуаниловых нуклеотидов, Sec12p (иначе называемый Sar-GEF), который представляет собой интегральный мембранный белок.
See12р активирует Sar1p, обменивая ГДФ на ГТФ.
Связывание Sar1p-ГТФ с мембраной активирует два структурных компонента белкового окаймления, гетеродимеры Sec23/Sec24 и Sec13/Sec31. По форме кристаллическая структура комплекса Sarlp-ГТФ-Sec23/24 напоминает галстук-бабочку и хорошо подходит к искривленной поверхности везикулы COPII. Поэтому полимеризацией этих комплексов с Sec13/31 можно объяснить деформацию и отпочковывание везикулы. Sec24 связывается с белком карго, заключенным в везикулу COPI. Наличие большого количества молекул карго, способных включиться в везикулу, можно объяснить присутствием множественных перекрывающихся сайтов связывания.
Три основных типа покрытий, характерных для процесса везикулярного транспорта,
представляют собой COPI, COPII и клатриновое окаймление.
Sec23 связывается непосредственно с Sar1p и стимулирует гидролиз связанного ГТФ при образовании везикулы или сразу после этого. Поэтому Sec23 действует как белок, активирующий ГТФазу (GAP), раздевающий везикулу и высвобождающий субъединицы окаймляющих белков для следующих циклов образования новой везикулы.
Большинство белков карго включаются в везикулы COPII либо за счет неизбирательного потока, либо используя сигналы сортировки. По механизму неизбирательного потока включается большинство растворимых секреторных белков, которые синтезируются в секреторных клетках в больших количествах.
Сигналы на экспорт белков из ЭПР обычно представляют собой короткие последовательности аминокислот, расположенные в цитоплазматическом участке молекулы мембранных белков. Из всех сигналов сортировки белков сигналы экспорта из ЭПР охарактеризованы наименее полно. Одним из примеров является последовательность, состоящая преимущественно из дикарбоновых аминокислот, присутствующая, например, в VSV G белке — гликопротеине оболочки вируса везикулярного стоматита, который широко использовался в исследованиях по биогенезу плазматической мембраны.
Наличие экспортного дикарбонового сигнала увеличивает эффективность экспорта белков из ЭПР, поскольку он связывается с компонентом Sec24 окаймляющего комплекса COPII.
Экспорт мутантного VSV G белка, в котором этот сигнал отсутствует, происходит в 2-3 раза медленнее, чем экспорт белка дикого типа.
Другим примером сигнала экспорта из ЭПР служит трансмембранный белок ERGIC-53 (ER, Golgi, белок промежуточного компартмента, с мол. массой 53 кДа). Предполагается, что этот белок переносит растворимые гликопротеины из ЭПР в аппарат Гольджи. Цитоплазматический участок молекулы белка содержит сигнал, представленный двумя остатками фенилаланина, который взаимодействует с компонентом Sec23/24 комплекса COPII. Существование этого сигнала необходимо для того, чтобы ERGIC-53 мог выйти из ЭПР.
Растворимые белки карго также могут использовать сигналы экспорта, однако непосредственно с ними не связываются. Вместо этого они связываются с рецепторами, которые находятся на COPII везикулах. Такой сигнал содержат растворимые белки, которые переносятся ERGIC-53 от ЭПР в аппарат Гольджи. Домен ERGIC-53, расположенный со стороны люмена, связывается с этими белками через богатые маннозой олигосахариды, которые находятся в большинстве гликопротеинов, выходящих из ЭПР. Однако, поскольку ERGIC-53 не связывает все гликопротеиды с повышенным содержанием маннозы, сигнал содержит и другие компоненты.
У больных с дефицитом белка ERGIC-53 развивается повышенная кровоточивость, связанная с пониженным содержанием факторов свертывания крови V и VIII. Или ERGIC-53 способен лишь к ограниченному транспорту других белков, или иные белки каким-то образом компенсируют его отсутствие.
Модель, описывающая последовательность этапов сборки COPII везикул,
с участием белков окаймления и молекул карго (v-SNARE и рецептор карго).
Еще один пример растворимого белка, который экспортируется из ЭПР под действием сигнала, представляет собой а-фактор — гликопротеин, секретируемый дрожжами S. cerevisiae и обеспечивающий их конъюгацию. Недавно идентифицирован белковый рецептор, пронизывающий мембрану, который концентрирует а-фактор в везикулах COPII.
Другой путь включения белков карго в COPII везикулы состоит в использовании белка упаковки, который сам в везикулу не поступает. Например, в плазматической мембране дрожжей содержится пермеаза аминокислот. Новосинтезированные пермеазы транспортируются по экзоцитозному пути к клеточной поверхности. Включение этих пермеаз в COPII везикулы ЭПР требует присутствия упаковочного белка (Shr3p), хотя механизм его действия неизвестен. Так же как и экспортные сигналы, упаковочные белки, по-видимо-му, лишь увеличивают эффективность процессов экспорта из ЭПР, хотя сами по себе не являются для них абсолютно необходимыми.
Компоненты транспортного механизма, такие как белки SNARE, которые обеспечивают причаливание и слияние везикул с мембранами, должны также включаться в везикулы. Каким образом SNARE, которые являются интегральными мембранными белками, включаются в везикулы COPII? Два белка из группы SNARE, участвующие в транспортных процессах из ЭПР в аппарат Гольджи (Betlp и Bos1p), связываются с мембранными формами Sar1p и Sec23/24. Это приводит к активации белка Sec 13/31, что свидетельствует о том, что белки SNARE включаются в механизм на стадии образования везикулы.
Одно из предположений заключается в том, что при образовании везикулы SNARE играют роль затравки и таким образом гарантируют наличие сигналов адресования во всех образующихся везикулах СОРИ. Однако данные, подтверждающие это заманчивое предположение, отсутствуют.
После отшнуровывания от ЭПР везикула COPII мигрирует в аппарат Гольджи, где происходит слияние. Везикулы COPII формируют кластеры и, возможно, сливаются друг с другом в экспортных сайтах ЭПР (образование «везикулярно-тубулярных кластеров» (VTC). Когда везикулы COPII образуются на экспортных сайтах, удаленных от аппарата Гольджи, VTC могут перемещаться до места назначения вдоль микротрубочек. Таким образом, пространственное расположение (близость ЭПР к аппарату Гольджи) и транспорт вдоль микротрубочек сказываются на эффективности, с которой везикулы COPII находят свое окончательное местоположение.
У почкующихся дрожжей ЭПР не обладает отдельными экспортными сайтами, и везикулы COPII могут образовываться в любом месте ЭПР. В отличие от клеток млекопитающих цистерны аппарата Гольджи находятся в цитоплазме, в основном в виде отдельных дисков. Таким образом, в почкующихся дрожжах везикулы COPII могут просто выбирать кратчайшее расстояние между сайтом своего образования в ЭПР и первой ближайшей цистерной.
Белки карго включаются в образующиеся COPII-везикулы по разным механизмам.
Сигнал экспорта из ЭПР включает последовательности,
содержащие остатки дикарбоновых аминокислот или два остатка фенилаланина.