Оценка качества трансплантата гемопоэтических стволовых клеток
Количество гемопоэтических стволовых клеток, необходимое для различных видов трансплантации, значительно варьирует и несомненно зависит от источника их получения (костный мозг, периферических стволовых клеток крови (ПСКК), пуповинная кровь).
Все образцы гемопоэтических стволовых клеток независимо от метода заготовки подвергаются исследованию на содержание ядросодержащих клеток, мононуклеаров, а также клеток CD34+. Образцы пуповинной крови (ПК) обследуют на стерильность, наличие гемотрансмиссивных инфекций, перечень которых представлен в Приказе МЗ РФ № 325 от 25.07.2003 г. «О развитии клеточных технологий в Российской Федерации», типируют по системе HLA; подвергают иммуногематологическому исследованию.
В образцах пуповинной крови большинство зарубежных исследователей рекомендуют определять количество КОЕ.
Для оценки исследуемых клеточных взвесей in vitro в большинстве лабораторий производят следующее:
• подсчет количества лейкоцитов и эритроцитов в камере Горяева методом световой микроскопии; определение относительного содержания клеток мононуклеарного ряда в концентрате гемопоэтических стволовых клеток;
• оценку количества КОЕ, КОЕ-Г/ГМ, БОЕ, колониеобразующих единиц эритропоэза (КОЕ-Е), КОЕ-ГЭММ на 1 кг массы тела реципиента после культивирования гемопоэтических стволовых клеток в полужидких средах, что помогает оценить влияние хранения на жизнеспособность гемопоэтических стволовых клеток и возможную скорость их приживления. Однако этот метод дает представление о качестве полученного трансплантата лишь через 14 дней после его заготовки;
• количественную идентификацию гемопоэтических стволовых клеток (CD34+, CD133+) с использованием специфических моноклональных антител и проточного цитофлуориметра, что является самым адекватным способом определения качества трансплантата.
Гемопоэтические стволовые клетки характеризуются наличием экспрессии высокогликозилированного мембранного гликопротеина с мол. массой 115 000 (CD34+-антиген), функция которого окончательно не установлена. CD34+-антиген выявляется на гемопоэтических стволовых клетках, субпопуляциях стромальных клеток, эндотелии мелких сосудов различных органов и других тканях.
Идентификация клеток CD34+ возможна методом иммунофлюоресценции. Экспрессия CD34+-антигена определяется на поверхности 1—4 % клеток нормального костного мозга, пуповинной крови или гемопоэтических стволовых клеток крови после их мобилизации с помощью цитостатических препаратов и/или рекомбинантных ростовых факторов.
В настоящее время чрезвычайно интенсивно изучается значение антигена CD133, который является гомологом трансмембранного гликопротеина (prominin 5-transmembrane glycoproteins — PROML 1), селективно экспрессируемого на 30—60 % CD34+-клеток, включая антигены CD34bright, CD34dim/neg, HLA-DR-, CD117+, CD90+, c-kit+. С0133-антиген также экспрессируется на КОЕ-ГМ, КОЕ-ГЭММ, клетках, инициирующих длительную культуру (LTCIC — long term culture initiating cells).
Экспрессия CD133-антигена установлена на эндотелиальных клетках. Показано, что популяция клеток CD133+CD34-, по всей видимости, является фракцией, ответственной за дифференцировку в миелоидный и лимфоидный ростки кроветворения.
Перспективность применения CD133+-клеток при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток изучается.
Для успешного проведения трансплантации гемопоэтических стволовых клеток клеточная взвесь аутологичного костного мозга (трансплантата) должна иметь более 1—2 • 108 ядросодержащих клеток на 1 кг массы тела реципиента, КОЕ-ГМ — более 1 • 104/кг. Для аллогенного костного мозга эти критерии составляют: ядросодержащих клеток более 2 • 108/кг, количество КОЕ-ГМ — более 5 • 104/кг.
Критерием адекватности дозы периферических стволовых клеток крови для аутологичной трансплантации является количество мононуклеаров, превышающее 4—8 • 108/кт, КОЕ-ГМ — более 10—50 • 104/кг, CD34+-клеток - более 2 • 106/кг, а для концентрата при алло-ТПСКК количество мононуклеаров более 6—8•108/кг, КОЕ-ГМ — более 10-50 • 104/кг, CD34+-клеток - более 5 • 106/кг.
Для успешного выполнения гаплоидентичной алло-трансплантации периферических стволовых клеток крови количество CD34+-клеток в трансплантате должно превышать 10 • 106 на 1 кг массы тела реципиента, количество CD3+-клеток быть менее 3•104/кг, CD20+-клеток - менее 3 • 104/кг. В этом случае повышенное содержание CD34+-клеток определяет вероятность приживления гемопоэтических стволовых клеток донора и является одним из способов профилактики острой РТПХ, накладывая «вето» на пролиферацию Т-лимфоцитов.
Кроме перечисленных критериев адекватности трансплантата, для предсказания успешности ауто-трансплантации периферических стволовых клеток крови необходимо учитывать, что предшествующее лечение алкилирующими препаратами, использование лучевой терапии, прогрессирование заболевания с поражением костного мозга в период мобилизации периферических стволовых клеток крови, а также пожилой возраст пациента могут снизить количество и качество мобилизованных клеток. Эти же факторы влияют на получение гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга при проведении миелоэксфузии.
Клеточность трансплантата оказывает влияние на отдаленные результаты после аутологичной и аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Так, 5-летняя общая выживаемость больных после алло-трансплантации гемопоэтических стволовых клеток составила 56, 51 и 45 % при количестве ядросодержащих клеток донора более 5 • 108, менее 5 • 108 и менее 2,4 • 108 на 1 кг массы тела реципиента соответственно.
Пятилетняя общая выживаемость после родственной алло-трансплантации гемопоэтических стволовых клеток при дозе CD34+-клеток менее и более 3 • 106 на 1 кг массы тела реципиента была равна 25 и 56 % соответственно.
При ауто-трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, особенно при ауто-ТКМ, длительность безрецидивной выживаемости больных с ОМЛ также зависела от клеточности трансплантата (снижение общей выживаемости при введении трансплантата с высоким количеством ядросодержащих клеток), что, вероятно, связано с величиной примеси злокачественных клеток, увеличивающейся пропорционально содержанию ядросодержащих элементов.
При сравнении безрецидивной выживаемости больных с острыми лейкозами после сингенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток также была установлена зависимость от количества ядросодержащих клеток в трансплантате. Пятилетняя безрецидивная выживаемость составила 53 и 35 % при клеточности трансплантата более 3 • 109/кг и менее 3 • 109/кг соответственно. Летальность, связанная с трансплантацией, была равна соответственно 2 и 10 %.
Объем пуповинной крови, получаемой при родах, не может в большинстве случаев обеспечить адекватное число гемопоэтических стволовых клеток для взрослого человека. В связи с этим трансплантация гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови применяется в основном у детей. Для успешного приживления трансплантата допустимое содержание ядросодержащих клеток более 3,7 • 107/кг.
Соблюдение указанных критериев при получении трансплантата обеспечивает успешность проведения любого вида трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у большинства больных. Тем не менее количественные характеристики не всегда адекватно отражают функциональное состояние гемопоэтических стволовых клеток в трансплантате. Для более полной оценки используется тестирование гемопоэтических стволовых клеток in vitro с определением КОЕ-Г/ГМ, БОЕ, КОЕ-Е, КОЕ-ГЭММ, уровня активности альдегиддегидрогеназы в клетках CD34+.
Однако эти параметры далеко не всегда однозначно коррелируют со скоростью восстановления гемопоэза, поэтому являются дополнительными (страхующими) характеристиками.
Как отмечалось, основными источниками гемопоэтических стволовых клеток при трансплантации служат костный мозг и периферические стволовые клетки крови. Каждый из этих вариантов имеет свои преимущества и недостатки при выполнении аутологичной и аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Получение периферических стволовых клеток крови у доноров для аллогенной трансплантации до сих пор подвергается обсуждению в связи с необходимостью назначения здоровому человеку медикаментозных препаратов (Г-КСФ), а в ряде стран применение периферических стволовых клеток крови запрещено при проведении алло-трансплантации гемопоэтических стволовых клеток от неродственного донора.
Тем не менее этот метод получения гемопоэтических стволовых клеток в настоящее время является доминирующим. По данным ЕВМТ, за 2003 г. выполнено 2380 алло-ТКМ и 4580 алло-трансплантаций периферических стволовых клеток крови. Этических проблем, связанных с использованием Г-КСФ, не возникает при получении аутологичных ПСКК, поэтому соотношение ауто-трансплантации костного мозга (ауто-ТКМ) и ауто-трансплантации периферических стволовых клеток крови (ауто-ТПСКК), по данным ЕВМТ, составило в 2003 г. 362 и 13 367 трансплантаций соответственно.
