Электрофорез гемоглобина в блоке крахмала - методика, показатели нормы
Принцип метода одинаков с заложенным в основу электрофоретического отделения сывороточных белков. В данном электрическом поле частицы, несущие определенную электрическую зарядку, перемещаются более или менее в зависимости от силы электрического поля, электрической зарядки, величины и формы молекулы.
Что касается гемоглобина основным фактором электрофоретического отделения является электрическая зарядка, поскольку форма и величина молекулы одинаковы для различных видов гемоглобина.
Электрофорез гемоглобина практикуется во всех используемых вариантах в отношении белков, в том числе, электрофорез на бумаге, в агаровом геле, в геле и блоке крахмала, в геле полиакриламида, на уксуснокислом целлюлозе. Каждая из этих разновидностей представляет свое преимущество, которое следует учитывать при выборе соответствующего метода.
Необходимая аппаратура — электрический источник питания и бак (ванна) для буфера; используемые материалы в качестве миграционной питательной среды почти полностью соответствуют применяемым для электрофореза сывороточных белков.
Электрофорез гемоглобина в блоке крахмала отличается рядом преимуществ, в силу которых ему отдается предпочтение при исследовании гемоглобинопатии. На этой питательной среде можно отделить почти все виды физиологического и патологического гемоглобина, даже когда он находится в малом концентрации. Не требует окраски. Промывание и количественная оценка осуществляются легко, используемый крахмал не требует специальной обработки, дешевый и побывается без затруднений.
Материалы для электрофореза гемоглобина в блоке крахмала: картофельный крахмал; аппарат для электрофореза, слагающийся из выпрямителя, бака для буфера и пластинки из плексигласса, на которую наносится крахмал; буфер веронал-мединал — 8,8 показатель водорода и 0,5 ионная мощность; веронал 1,84; мединал 10,8; лактат кальция 0,384; дистилированная вода до 1000 мл; 2% раствор цианистого натрия.
Методика электрофореза гемоглобина в блоке крахмала
В стекляную или эмалированную посуду насыпать 150—200г крахмала и залить 300—400 мл дистилированной воды. Помешать, после осаждения крахмала слить воду и налить буфер веронал-мединал; хорошо перемешать и оставить 30—40 минут, в случае надобности можно сохранить на ночь в холодильнике. После гомогенизации приготовленный таким образом крахмал наносится на пластинку плексигласса, при этом слой его должен иметь 5 мм толщины.
Поскольку по краям пластинки имеется ободочек соответствующей толщины, крахмал не стекает с пластинки. Слой оседаемого крахмала однородный. Лишнее количество буфера удалить фильтровальной бумагой.
На одну пластинку крахмала можно нанести одновременно несколько проб для миграции, причем их число зависит от величины пластинки. Наносить их (по 2—3 капли) на расстоянии 4—5 см от края пластинки, между образцами оставлять расстояние 3—4 см.
До начала миграции гемолизаты обработать цианистым натрием в целях преобразования гемоглобина в цианметгемоглобин — весьма устойчивый вид. На 5—6 капель раствора гемоглобина добавить каплю 2% раствора цианистого натрия.
Пластинку спустить в бак, при этом пятна направляются в сторону отрицательных электродов; связь с буферным раствором наладить с помощью фильтровальной бумаги. Миграция происходит при напряжении 200 вольт, ампераж в зависимости от размеров пластинки с крахмалом и толщины слоя последнего. Время миграции 18—20 часов.
В описанных условиях проба гемоглобина от человека в норме мигрирует от отрицательного к положительному полюсу и делится на две фракции: основную (97—98%) на первом плане, представляющую собой гемоглобин А1, а позади, на расстоянии 3—4 см, вторую (2—3%), составляющую гемоглобин А2.
При таких условиях из крови пуповины также отделяются две фракции: одна из них составляет 30—40% — гемоглобин А1, вторая — гемоглобин Ф, расположенная между гемоглобином А1 и гемоглобином А2, на очень близком расстоянии от первого.
Количественное определение отделенных, путем электрофореза, фракций осуществляется промыванием а затем фотометрированием.
Отделенные пятна вырезать и каждый из них вложить в пробирку. В другой пробирке промыть участок чистого крахмала, соответствующего по величине площади, занимаемой гемоглобином А2, в качестве контрольного препарата для фотометрирования.
В каждую пробирку влить одинаковое количество буфера. Взболтать, гемоглобин переходит в раствор, в то время как крахмал оседает на дно пробирки. После оседания надосадочную массу профильтровать, процентрифугировать и прочитать результат с помощью фотометра или спектрофотометра с фильтром, соответствующим длине волны 540 нм. Значение данной фракции в процентном отношении выводится из суммы экстинкий, составляющей 100% экстинкций каждой фракции, деленной на общую экстинкцию.
Нормальные физиологические значения гемоглобина, полученные в подобных условиях, составляют 2—3% гемоглобина А2 и 97—98% гемоглобина А1.
Если подвергнуть электрофорезу раствор гемоглобина из крови больного с аномальным гемоглобином, то последняя, в зависимости от имеющейся в ней электрической зарядки, мигрирует медленнее или быстрее нормального гемоглобина, тем самым способствуя ее отделению и количественному определению.
Вливаемый в ванну буфер можно исплоьзовать несколько раз, при условии изменения направления тока после каждой миграции.
