Основные принципы цитогенетической пренатальной диагностики.
В настоящее время проблема цитогенетической диагностики при любом сроке беременности практически решена. Разработаны надежные и эффективные методы хромосомного анализа клеток плода и зародышевых оболочек. В зависимости от срока беременности и задач исследования материалом для хромосомного анализа могут служить клетки АЖ, хориона, плаценты и лимфоциты пуповинной крови плода, полученные тем или иным инвазинным способом. В нашем центре наиболее часто используются клетки хориона (I триместр) или клетки плаценты (II триместр), полученные с помощью трансабдоминальной хорионбиопсии или плацентоцентеза. Хромосомные препараты из тканей хориона или плаценты готовят прямым или непрямым методами, детально рассмотренными ранее в методических рекомендациях и соответствующем руководстве.
Преимущества и недостатки цитогенетического анализа при использовании разных методов получения хромосомных препаратов из образцов плодного материала представлены в табл.
Использование в большинстве центров комплекса цитогенетических и молекулярно-цитогенетических методов диагностики позволяет получить наиболее полную информацию о кариотипе плода на разных стадиях внутриутробного развития.
При пренатальном кариотипировании следует руководствоваться принципами анализа препаратов хромосом, принятыми в международной клинической цитогенетике и утвержденными Министерством здравоохранения РФ, а также правилами международной номенклатуры описания карнотита.
Особенности цитогенетического анализа клеток различного плодного происхождения Клетки амниотической жидкости Клетки АЖ представлены несколькими типами различного происхождения:
— клетки амниотической оболочки (собственно амниоциты),
- эпителиальные клетки плода (эпидермиса, пищеварительного тракта, мочеполовых и дыхательных путей, слизистой оболочки ротовой полости).
Характеристика методов получения цитогенетических препаратов для кариотипирования плода
Количественный и качественный состав клеток АЖ, а также концентрация жизнеспособных клеток имеют индивидуальную вариабельность и зависят от стадии развития. Оптимальным для цитогенетических исследований является амниотический эпителий — активно пролиферирующий клон клеток, специфический для данной культуры. Между тем точная идентификация типов клеток, способных к митотическим делениям и клонообразованию в условиях клеточных культур in vitro, весьма затруднена.
Наиболее часто для культивирования используют амниотические клетки, полученные в срок 15—18 нед беременности. Использование для этих целей амниоцитов более ранних (12-14 нед беременности) или более поздних (после 20 нед беременности) сроков принципиально возможно, но, как правило, резко осложняет и удлиняет процесс диагностики, увеличивает число неудачных попыток.
Стандартное культивирование клеток АЖ включает следующие этапы: постановку культуры, субкультивирование, гипотоническую обработку и фиксацию. Несмотря на широкое использование культур клеток АЖ в мировой практике, единой методики для получения из них хромосомных препаратов не существует. Для культивирования клеток АЖ используют два основных подхода, различающихся по способу получения колоний и методам фиксации.
1. Flask-метод-культивирование клеток во флаконах и фиксация суспензии монослойной культуры после трипсинизации. Анализ проводят в двух из трех культур (по 10 метафаз для каждого образца). Если во всех метафазных пластинках наблюдается одинаковый кариотип, диагноз считается установленным. В случае обнаружения единичной метафазы с аберрантным кариотипом (числовым или структурным), анализируется резервная третья культура. Если одна и та же хромосомная аберрация определяется более, чем в одной метафазе из одного флакона, но не подтверждается в остальных флаконах, ставится диагноз «псевдомозаицизм». В случае обнаружения одной и той же хромосомной аномалии более чем в одном флаконе, устанавливается диагноз «истинный мозаицизм».
2. Метод in situ - культивирование и фиксация клеток на покровных стеклах в чашках Петри или специальных флаконах - слайдах. Анализ проводят по метафазным пластинкам из трех культуральных чашек (всего анализируют 10 колоний). При выявлении аномального клона анализируют всекультуры. Хромосомная аберрация, наблюдаемая лишь в одной чашке, свидетельствует о «псевдомозаицизме», более чем в одной — об «истинном мозаигшзме».
Процесс стандартного культивирования амниоцитов с момента получения образца АЖ до кариотипирования занимает в среднем 14—21 день. К недостаткам можно отнести высокую стоимость культуральных питательных сред и оборудования, что немаловажно для отечественных лабораторий, а также высокую (до 2%) вероятность контаминации образца клетками материнского происхождения.
В последние годы разработан принципиально новый подход к анализу хромосом из культивированных клеток. Метод «pipett» основан на микроманипуляционной изоляции метафазныхипрометафазныхклетокиз несуспензионных культур благодаря ихморфологическим особенностям и ослаблению связи с субстратом. Дальнейшая гипотоническая обработка и фиксация проводятся на единичных клетках. Этот способ позволяет сократить период культивирования до несколькихдней и, что особенно существенно, снизить риск диагностических ошибок, обусловленных как мозаицизмом, так и контаминацией образца. Получение прометафазных и метафазных пластинок таким способом возможно из любых первичных и перевиваемых культур. К сожалению, дорогостоящее оборудование и трудоемкость препятствуют широкому внедрению этого прогрессивного метода в клиническую практику.
