Сочетание ПЦР и культивирования. Ценность методов культивирования в стоматологии
Интересным примером сочетания двух методов — ПЦР и культивирования — является исследования ДНК (РНК) для обнаружения патогенных микроорганизмов, вызывающих болезни пародонта, с использованием бактериальной культуры. На первом этапе проводят посев клинических образцов на микробиологические среды (первичный бактериальный посев). Затем полученная смешанная бактериальная культура изучается с помощью методов молекулярной диагностики. Данный подход позволяет идентифицировать намного большее количество образцов бактериального налета и зубных бляшек, сокращает суммарное время анализа и повышает чувствительность метода исследования благодаря молекулярным методам, но в то же время первичный посев снимает проблему излишней чувствительности метода ПЦР.
Ряд авторов указывают на расхождение данных, полученных с помощью культуральных методов, и результатами исследований с применением молекулярных методов диагностики микрофлоры ротовой полости. Это объясняется, в частности, несовершенством принятых в классической микробиологии способов видовой идентификации бактерий посредством изучения их биохимических характеристик, а также наличием в клинических образцах некультивируемых микроорганизмов. Например, из 160 образцов, полученных культуральным методом и достоверно определенных на основе биохимических характеристик как P. intermedia, 29 были идентифицированы неверно. При оценке методом ПЦР 24 из них оказались P. nigrescens, 4 — Prevotella spp., 1 — Porphyromonas spp.
Развитие новых технологий позволило разработать большое количество молекулярных методов, основанных на ПЦР, которые имеют значительные преимущества в скорости и чувствительности. Одним из молекулярных методов является ПЦР в реальном времени (real-time PCR). Она позволяет проводить детекцию продуктов амплификации в процессе реакции и вести мониторинг кинетики накопления ампликонов. Детекция продуктов амплификации проводится в реакционном растворе за счет специфичной гибридизации продукта с олигонуклеотидным зондом, несущим флюоресцентную метку. В процессе реакции происходит высвобождение флюоресцентной метки в раствор, что дает возможность ее определения на флюоресцентном детекторе.
Метод демонстрирует высокую положительную прогнозирующую ценность в обнаружении некультивируемых и трудно культивируемых видов бактерий. В сравнительных исследованиях поддесневых образцов бляшки от 259 пациентов с тяжелым пародонтитом отмечена высокая линейная корреляция между положительными и отрицательными результатами бактериального метода и ПЦР в реальном времени. Эти результаты подтверждаются другими исследованиями. Также найдена положительная корреляция между ПЦР и бактериологическими методами в количественной оценке бактерий, начиная с 104 бактериальных клеток в 1 мл.
Таким образом, метод ПЦР имеет решающее значение для диагностики представителей анаэробной микрофлоры, микроаэрофилов, внутриклеточных паразитов, так как они относятся к некультивируемым или трудно культивируемым микроорганизмам.
Однако метод ПЦР при своей все более увеличивающейся популярности ни в коем случае не заменяет, а лишь дополняет спектр традиционных методов (микроскопический, культуральный, биохимический и т. д.), используемых в диагностике заболеваний пародонта.
Учитывая достоинства и недостатки различных методов идентификации микроорганизмов, рекомендуется проведение комплексных клинико-лабораторных исследований. Изучение микрофлоры ротовой полости с применением комплекса микробиологических методов — от классических до молекулярных — способно помочь в решении многих фундаментальных и прикладных задач стоматологии:
• диагностика инфекционных заболеваний (определение качественного и количественного состава микрофлоры ротовой полости);
• определение антибиотикоустойчивости исследуемых микроорганизмов;
• осуществление контроля эффективности лечения.
