Ценность иммунохимических методов анализа. Гибридизация in situ в стоматологии
Флюоресцентно меченные антитела используются для молекулярной диагностики поверхностных антигенов, таких как капсулярные, флагеллярные белки, полисахариды, или внутриклеточных антигенов (рибосомные белки, или белки, специфические для цитоплазматических протеинов).
Иммунохимические методы ограниченно пригодны для идентификации микроорганизмов, поскольку с их помощью сложно разграничить штаммы одного и того же вида (обладают сходными антигенными детерминантами и возможны ложноположительные результаты), и непригодны для определения некультивируемых микроорганизмов, так как невозможно получить очищенные антигены для иммунизации животного.
Решением этой проблемы могут служить антитела с флюоресцентной меткой, специфически взаимодействующие с определенной последовательностью нуклеотидов рибосомной РНК.
Гибридизация in situ в стоматологии
Гибридизация in situ — это молекулярно-биологический метод, основанный на специфической гибридизации специального олигонуклеотидного зонда с РНК рибосомы. Рибосомы присутствуют во всех клетках, и их структура хорошо изучена. Определенные участки рибосомной РНК не покрыты белками и могут взаимодействовать по принципу комплементарности с нуклеотидными зондами, помеченными флюоресцентными красителями или антителом. Последовательность нуклеотидов зонда подбирается таким образом, чтобы связываться с рРНК только одного вида клеток, что позволяет выявлять такие клетки под микроскопом. Процедура гибридизации in situ следующая: клетки фиксируются (на подложке или в тонком срезе) и в процессе фиксации погибают. Мертвая клетка становится проницаемой для крупных молекул, в том числе для олигонуклеотидных зондов.
На слой клеток наносится краситель с зондами, которые проникают внутрь клетки, связываются там с рРНК, если она комплементарна их последовательности. Через некоторое время избыточное количество красителя отмывают, а связавшиеся зонды обнаруживают микроскопически по развитию той или иной окраски. Если целевых последовательностей рРНК нет, то цветной реакции не наблюдается. При использовании флюоресцентных красителей метод называется FISH — флюоресцентная гибридизация in situ.
Метод достаточно прост и в соединении с проточной цитометрией используется для количественного анализа микробных сообществ. Кроме того, с его помощью можно выявлять растущие молодые клетки, в которых много действующих рибосом и, следовательно, окраска у них более интенсивная.
Последние модификации данного метода позволяют обнаруживать низкокопийные плазмиды (от 10 до 1000 копий на клетку) или хромосомы (менее 10 копий). Эти методы отличаются от pPHK-FISH использованием полинуклеотидных зондов (от 50 до 1200 нуклеотидов в длину), высокой (1000-кратной) концентрацией зонда и более долгим временем гибридизации. Техника называется RING-FISH из-за того, что вокруг целевых клеток образуется круговое сияние флюоресценции. Метод также может быть использован для обнаружения клеток, зараженных вирусом или внутриклеточными паразитами.
При всех своих достоинствах метод обладает определенными ограничениями. Во-первых, для эффективного микроскопирования клетки обязательно нужно концентрировать, что не всегда возможно. Во-вторых, при фиксации клеток структура рибосом нередко изменяется таким образом, что целевой участок рРНК становится физически недоступным для зонда и приходится применять особые техники (добавление формамида) для его обнаружения. В-третьих, медленно растущие клетки трудно обнаружить из-за низкого количества в них рибосом.
