Капиллярный электрофорез в стоматологии. Иммунохимические методы анализа
Капиллярный электрофорез — относительно новый метод идентификации микроорганизмов Он основан на разделении одиночных клеток в электрическом поле в соответствии с их поверхностным зарядом. Этот заряд формируется за счет ионизации основных или кислотных группировок (карбокси-, амино-, органофосфатных групп, иногда сульфатных) на поверхности клетки, зависит от свойств клетки: ее типа, возраста, физиологических условий — и может изменяться после дифференцировки, обработки антибиотиками, химическими веществами.
Клеточная стенка грамотрицательных микробов состоит из трех слоев: бислой липидов, тонкий слой пептидогликанов, внешний двойной слой, покрытый липополисахаридами. Последние и формируют заряд грамотрицательных микроорганизмов. Грамположительные микробы имеют на поверхности толстый слой пептидогликанов, в составе которых преобладает тейхоевая кислота, за счет нее формируется отрицательный заряд. Вирусы имеют внешний белковый слой на мембране. Остатки аминокислот также способны заряжаться. Мембраны и клеточная стенка грибов содержат белки и липидные молекулы, придающие им характеристический заряд в зависимости от рН, вида ионов, состава электролитов и температуры. При этом многие бактерии могут соединяться в цепочки и кластеры, что тоже будет выявлено их движением в электрическом поле. Клетки легко можно сделать видимыми, окрашивая их флюоресцентными красителями.
Капиллярный электрофорез — быстрый, с высокой разрешающей способностью метод с минимальной подготовкой образца. Недостатками метода являются требовательность в подготовке образцов клеток к анализу, поскольку уже небольшое изменение рН, концентрации ионов, кислорода приводит к изменению заряда и невоспроизводимым результатам, и небольшое количество клеток, которые можно анализировать одновременно, — от 3 до 15.
Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, вошли в аналитическую практику и широко используются в различных областях медицины. Как правило, к антителу прикрепляется метка, которая обнаруживает себя при образовании комплекса «антиген — антитело». В качестве метки может использоваться фермент, осуществляющий цветную реакцию (иммуноферментный анализ), или флюоресцентный краситель (иммунофлюоресценция).
Антигеном — веществом, против которого могут быть получены антитела, могут являться белки, полисахариды, реже — нуклеиновые кислоты, т. е. довольно крупные молекулы или клетки, на поверхности которых такие молекулы имеются. Таким образом, иммунохимические методы выявляют не возбудителя заболевания, а молекулы, сопутствующие ему, следовательно, они являются непрямыми методами анализа.
Эпитопы распознаются антителами с достаточно высокой специфичностью: разные антитела образуются уже при перемещении одной и той же группировки к соседнему атому углерода.
Количество эпитопов — участков поверхности антигена, с которыми может связываться антитело, принципиально не ограничено и составляет до десятков у крупных белков.
Наибольшее распространение среди ферментов в настоящее время получили пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза. Для фотометрической регистрации активности пероксидазы предпочтительным в настоящее время является использование субстрата тетраметилбензидина. После остановки ферментативной реакции серной кислотой измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 450 нм. Анализ проводят следующим образом. В лунки полистирольного планшета с сорбированными в них антителами вносят анализируемый образец, инкубируют в течение 1 ч, при этом анализируемый антиген вступает в реакцию с антителами и образует иммунокомплекс на поверхности лунок. Планшет отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка меченых антител добавляют субстрат фермента и определяют скорость его превращения в окрашенный продукт, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.
Для получения антител к нужному антигену (например, к поверхностному полисахариду микроорганизма) антиген нужно получить в чистом виде и иммунизировать им животное (обычно кролика). Антитела, которые образуются в крови иммунизированного животного, связываются с различными эпитопами молекулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлональным препаратом.
Проблемы виммунохимического анализа полне разрешимы при использовании моноклональных антител, реагирующих с одним-единственным эпитопом на поверхности молекулы-мишени. Однако препараты моноклональных антител дороги, так как их получают из генно-инженерной культуры клеток, а также зачастую имеют сравнительно низкое сродство к субстрату, низкую аффинность.
