Генетическое тестирование — исследование генетического материала для получения информации о состоянии здоровья человека методом хромосомного (цитогенетического) анализа или молекулярно-генетических методов, основанных на ДНК-тестировании.
а) Диагностическое тестирование. Диагностическое генетическое тестирование позволяет объяснить совокупность признаков, присущих тому или иному заболеванию. Список заболеваний, для которых доступны специфические генетические тесты, обширен. Многие можно найти через форму поиска по сайту выше.
Существует три различных подхода к тестированию на носительство моногенных заболеваний: анализ сцепления (сейчас используется редко), сравнительная геномная гибридизация на микрочипах (микроматричный анализ, aCGH) и прямой анализ мутаций, проводимый путем секвенирования ДНК (табл. 1). Анализ сцепления производится, если ответственный ген картирован, но еще не идентифицирован или если идентификация отдельных мутаций нецелесообразна из-за больших и множественных мутаций в некоторых генах.
Для обнаружения множественных делеций или дупликаций (вариации числа копий) можно использовать матричную сравнительную геномную гибридизацию. С увеличением разрешения с помощью aCGH могут быть обнаружены отдельные гены или меньшие в/генные делеции или дупликации. Но покрытие отдельных генов может отличаться у каждого производителя. Прямой анализ мутаций ДНК предпочтителен и осуществляется благодаря доступности полногеномного секвенирования. Новый аспект — растущее распознавание олигогенной болезни, когда мутации сразу в нескольких генах определяют сложный или «смешанный» фенотип.
Возможность секвенировать от сотен до тысяч генов одновременно дала понимание этого дополнительного уровня сложности в патогенезе болезни.
Анализ сцепления — отслеживание генетического признака в семье путем использования ассоциации полиморфных маркеров вместо прямой детекции самого гена (рис. ниже). Метод требует обследования нескольких членов семьи и оказывается ненадежным в случаях возможной генетической рекомбинации, генетической гетерогенности и неправильного диагноза у пробанда. Генетическая рекомбинация происходит между любой парой локусов, ее частота пропорциональна расстоянию между ними. Эту проблему можно решить, используя очень тесно сцепленные маркеры и маркеры, фланкирующие конкретный ген.
Использование анализа сцепления в пренатальной диагностике аутосомно-рецессивного заболевания. Оба родителя — носители, и у них есть больной сын. Цифры под символами указывают аллели в трех полиморфных локусах: А, В и С. Локус В находится в гене болезни. Больной сын унаследовал хромосому 1-2-2 от отца и хромосому 2-1-2 от матери. Плод унаследовал ту же хромосому от отца, но хромосому 3-2-4 от матери и, скорее всего, будет носителем
Генетическая гетерогенность может быть проблемой для анализа сцепления при существовании нескольких различных геномных локусов, которые могут влиять на один и тот же фенотип. Возникает риск, что исследуемый окус не будет локусом, ответственным за болезнь в данной семье. Неправильный диагноз у пробанда также ведет к отслеживанию неправильного гена. Анализ сцепления эффективен для некоторых генетических заболеваний, но с появлением доступных методов ему на смену приходит прямое секвенирование ДНК отдельных генов или всего набора генов, кодирующих все белки. Важно предоставить семье генетическое консультирование для объяснения сложностей интерпретации результатов анализов.
Сравнительная геномная гибридизация на микрочипах (микроматричный анализ) позволяет обнаружить изменение числа копий ДНК пациента в сравнении со стандартной контрольной ДНК. При этом aCGH обеспечивает уровень генетического разрешения между результатами секвенирования ДНК и хромосомным анализом. Более ранние технологии могут идентифицировать только большие делеции или дупликации, охватывавшие несколько генов, aCGH позволяет выявлять делеции или дупликации нескольких тысяч пар оснований в пределах одного гена.
Теоретически этот метод может обнаруживать делеционные и дупликационные мутации, которые могут быть пропущены при использовании хромосомного анализа, либо выявлять мутации, тестируемые секвенированием ДНК. Но доступное разрешение и покрытие различных платформ aCGH могут сильно различаться для разных областей гена, поэтому чувствительность обнаружения делеций и дупликаций для разных заболеваний и лабораторий также может различаться. Наивысшее разрешение — обнаружение делеции или дупликации одного экзона.
Прямая ДНК-диагностика мутаций позволяет избежать подводных камней анализа сцепления за счет обнаружения непосредственно генной мутации (т.е. изменения нуклеотидной последовательности). Используется специфический метод, адаптированный к биологии тестируемого гена. При некоторых заболеваниях у всех пациентов присутствует одна или небольшое количество различных мутаций.
Пример — СКА, при которой одна и та же замена нуклеотида обнаруживается у всех пациентов с этим заболеванием. В других случаях причина возникновения одного и того же заболевания у разных людей — множество возможных мутаций в одном гене. Например, при муковисцидозе в гене CFTR обнаружено >1000 различных мутаций. Анализ мутаций — сложная задача, потому что ни один метод не может обнаружить все возможные мутации. С завершением расшифровки последовательности генома человека и технологии высокопроизводительного секвенирования ДНК методом выбора считается прямое секвенирование ДНК на основе ПЦР-амплификации ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови.
Недостаток этого метода заключается в том, что секвенируют только амплифицированную ДНК, ограничиваясь кодирующими или экзонными областями гена. Поскольку мутации иногда возникают в некодирующих интронных областях, невыявление мутации не исключает диагноз. Полногеномное секвенирование должно идентифицировать мутации и в некодирующих областях. При этом гены в делетированном регионе не будут обнаружены. Хотя секвенирование ДНК может быть высокоспецифичным, метод не считается достаточно чувствительным из-за практических ограничений коммерчески доступного материала. Методы секвенирования генов могут не идентифицировать болезни экспансии (повторов) тринуклеотидных повторов: для этого нужны специальные тесты.
Наиболее практически значимое достижение в клинической ДНК-диагностике — применение технологии секвенирования следующего поколения для анализа панелей генов, ответственных за симптоматику заболевания (судороги, синдромы атаксии) или всего экзома (полноэкзомное секвенирование, WES). Вскоре полногеномное секвенирование, позволяющее идентифицировать кодирующие и некодирующие последовательности, будет способно предоставить еще больше информации. Но первоначальная клиническая интерпретация будет по-прежнему ограничиваться кодирующими последовательностями ~20 000 человеческих генов, так называемого цифрового экзома, поскольку он определяется электронным путем на основе полногеномных данных. Задача состоит не столько в прочтении последовательности ДНК, сколько в интерпретации огромного количества генетических вариаций.
Прямое секвенирование от десятков до сотен генов в панелях секвенирования следующего поколения обладает более высоким потенциалом чувствительности, поскольку «глубина» считывания выше. При этом интерпретация не усложняется большим числом вариантов с неопределенной клинической значимостью (VUS). Секвенирование полного экзома и полногеномное секвенирование также обладают потенциалом для выявления новых ассоциаций «ген-болезнь», а также фенотипов, обусловленных комбинациями генов болезни (т.е. олигогенных фенотипов).
Важный этический аспект — оповещение пациента о случайных находках, независимо от их клинической значимости. Секвенирование полного экзома и полногеномное секвенирование могут идентифицировать клинически значимые мутации, произошедшие в результате ототоксичности аминогликозидов и вызывающие потерю слуха. В то же время обнаружение у ребенка вариантов аполипопротеина Е, которые увеличивают риск возникновения болезни Альцгеймера, может не иметь клинического значения. Важно, чтобы во время консультации пациенту сообщали только результаты, имеющие для него клиническую значимость.
Американский колледж медицинской генетики разрабатывает методические рекомендации относительно оповещения пациента о неожиданных находках при WES. В американских ЛПУ единого подхода к этому вопросу пока не существует; международные генетические организации также придерживаются различных рекомендаций по оповещению пациента о случайных обнаружениях при WES или WGS, многие оставляют этот вопрос на усмотрение пациента и его семьи.
В большинстве случаев рекомендуют раскрытие пациенту или его семье серьезных (требующих медицинского вмешательства) заболеваний с одновременным предложением оптимальной и успешной стратегии лечения или профилактики (табл. 2). Генетическое тестирование должно соответствовать трем критериям: аналитической надежности, клинической надежности и клинической эффективности. Аналитическая надежность — точность теста: правильно ли он определяет наличие или отсутствие мутации. Большинство генетических тестов имеет очень высокую аналитическую надежность при гарантии, что персоналом не было допущено ошибки, например путаницы образцов.
Вероятность человеческой ошибки существует всегда, но, в отличие от большинства медицинских тестов, генетический тест вряд ли будет повторен, так как считается, что его результат с течением времени остается неизменным. Человеческие ошибки могут оставаться незамеченными в течение длительного времени. Но по мере накопления информации о мутациях в генах, ответственных за возникновение заболеваний, результаты тестирования могут быть переосмыслены.
Клиническая надежность — степень, в которой тест правильно прогнозирует наличие или отсутствие заболевания. Однако всегда существует вероятность получения л/п- и л/о-результатов тестирования. Получение л/п-результатов более характерно для прогностических тестов, чем для диагностических. Важный фактор — неполная пенетрантность: у человека с генотипом группы риска может не наблюдаться клинически выраженных симптомов. Др. фактор — обнаружение генетического варианта с неопределенной клинической значимостью (VUS). Обнаружение у пациента какого-либо варианта базовой последовательности не доказывает, что именно он — причина заболевания.
Секвенирование полного экзома может идентифицировать >30 000 генетических вариантов с неопределенной клинической значимостью; полногеномное секвенирование — >3 000 000 VUS. Для установления патогенности пользуются различными критериями. К ним относятся обнаружение генетического варианта только у индивидов с заболеванием: это позволяет заключить, что данный вариант изменяет функцию генного продукта, определяет сохранение модифицированной аминокислоты в процессе эволюции и совместную сегрегацию мутации и заболевания в семье. В некоторых случаях можно быть уверенным в патогенности или незначимости генетического варианта, но иногда окончательно определить причинную связь со 100% уверенностью невозможно. Л/о-результаты отображают неспособность обнаружить мутацию у пациента с заболеванием.
Это происходит при заболеваниях, для которых характерна генетическая гетерогенность: аллельная (заболевание вызвано различными мутациями в одном гене) или локусная (причиной заболевания могут быть мутации в нескольких генах). Обнаружение всех возможных мутаций в гене — трудная задача, потому что они могут различаться по типу и по своей локализации. При прямом секвенировании могут быть пропущены делеции или перестройки генов (структурные варианты), а мутации могут быть обнаружены в некодирующих последовательностях, таких как интроны или промотор; отрицательный тест ДНК не исключает клинический диагноз.
Клиническая целесообразность — степень, в которой результаты теста определяют клиническое вмешательство. Клиническая целесообразность генетического тестирования состоит в установлении диагноза, что позволяет избежать дополнительных обследований или изменить тактику наблюдения или лечения. Результаты анализов также могут быть использованы в качестве основных критериев для генетического консультирования. Для некоторых заболеваний генетическое тестирование доступно, но его результаты не влияют на клиническую оценку ситуации. Если диагноз и генетические последствия уже ясны, то проведение генетического тестирования не требуется.
б) Прогностическое тестирование. Прогностическое генетическое тестирование заключается в проведении пресимптоматической диагностики бессимптомному пациенту, у которого, по результатам семейного анамнеза, существует риск развития генетического заболевания. Это делается при заболеваниях, характеризующихся возрастной пенетрантностью; вероятность проявления признаков и симптомов увеличивается с возрастом, как при онкологических заболеваниях или болезни Гентингтона.
Главная проблема при прогностическом тестировании — наличие мутации гена не означает обязательное развитие болезни. Многие болезни с возрастной пенетрантностью проявляют неполную пенетрантность. У человека, унаследовавшего мутацию, признаки заболевания могут никогда не появиться. Существует опасение, что положительный результат теста ДНК может привести к стигматизации человека, не предоставляя при этом информацию, которая послужила бы ориентиром при выборе правильной тактики лечения. Стигматизация может происходить на уровне психологического стресса, но также может обозначать дискриминацию: отказ в страховании здоровья, жизни, в пособии по инвалидности или предоставлении работы.
Существует общепринятое мнение, согласно которому прогностические генетические тесты должны проводиться для детей только в том случае, если их результаты могут оказаться полезными при медицинском ведении пациента. В противном случае тест следует отложить до тех пор, пока ребенок не осознает риски и преимущества тестирования и не сможет дать информированное согласие. В отдельных штатах США предусмотрена разная степень защиты от дискриминации по результатам генетического тестирования. Важная веха в предупреждении генетической дискриминации — принятие в 2008 г. ФЗ о запрете дискриминации на основе генетической информации (Genetic Information Nondiscrimination Act, GINA) в сфере медицинского страхования или занятости, но не защищающего от отказа в страховании жизни.
в) Тестирование на предрасположенность к заболеваниям. В скором времени будут доступны генетические тесты, позволяющие прогнозировать риск возникновения заболевания. Наиболее распространенные болезни имеют мультифакторную этиологию; множество различных генов могут способствовать повышению риска развития заболеваний (глава 99). Большинство генетических вариантов, которые коррелируют с риском общего заболевания, лишь слегка увеличивают относительный риск, что не влияет на тактику ведения пациента. Дальнейшее выявление генов наиболее распространенных заболеваний позволит обнаружить варианты, связанные с более значительным уровнем риска. Также возможно, что одновременное тестирование нескольких генов предоставит больше информации о существующем риске, чем тестирование вариантов в отдельных генах.
Обоснование для тестирования на генетическую предрасположенность к заболеваниям — возможность использования полученных результатов для разработки стратегий снижения риска в рамках индивидуального подхода к сохранению здоровья пациента. Такие стратегии могут состоять в устранении негативного воздействия факторов окружающей среды, увеличивающего риск заболевания (курение сигарет и дефицит α1-антитрипсина), медицинского наблюдения (наследственный рак груди и маммография) или фармакотерапии (статины и гиперхолестеринемия). Важность тестирования на генетическую предрасположенность к заболеваниям необходимо оценивать критически по результатам исследований, проводимых по мере разработки этих тестов.
г) Фармакогенетическое тестирование. Полиморфизм генов метаболизма ЛС может приводить к различным паттернам абсорбции, метаболизма, выведения или эффективности лекарств. Знание индивидуальных генотипов будет иметь определяющее значение в выборе фармакотерапии, позволяя уточнять выбор ЛП и дозировки во избежание токсичности и для обеспечения терапевтического ответа. Пример — тестирование полиморфизма гена метилентетрагидрофолатредуктазы на повышенную предрасположенность к интоксикации метотрексатом у больных острым лимфобластным лейкозом, получающих антиметаболитную терапию.
