Тест восстановления метгемоглобина (метод Brewer) при недостатке ферментов в эритроцитах
Тест восстановления метгемоглобина (метод Brewer) основан на следующем принципе: окисляется гемоглобин эритроцитов с помощью нитрита натрия и преобразуется в метгемоглобин. Последний снова превращается в гемоглобин посредством ферментативной реакции, происходящей в присутствии метиленблау, ролью которого является активация НАДФ и метгемоглобинредуктазы в нормальных эритроцитах, в то время как на эритроциты с недостатком Г-6-ПД не влияет.
Реагенты для теста восстановления метгемоглобина: раствор (а) содержит 1,25 г. нитрита натрия и 5,0 г. глюкозы в 100 мл. дистилированной воды (концентрация соответствующих веществ равна 0,18 М NaNО2 и 0,28 М глюкозы); раствор (б) содержит 0,15 г. тригидрированного метиленблау в 1000 мл дистилированной воды.
Метод теста восстановления метгемоглобина. Используются три пробирки для гемолиза, в которые вводятся по 2 мл цельной крови. Пробирки помечаются цифрами от 1 до 3. В пробирку № 1 поместить лишь 2 мл. крови; в пробирку № 2 влить также по 0,1 мл. растворов (а) и (б), а в пробирку № 3 лишь 0,1 мл раствора (а).
Все подвергается процессу инкубации в течение 3 часов, при температуре 37°С. После инкубации добавляется по одной капле из каждой пробы на 10 мл дистилированной воды. Исследуется при дневном свете цвет полученных гемолизатов. (Когда подлежащая исследованию кровь характеризуется малым гематокритом, устранить необходимое количество плазмы для получения 40—45% гематокрита).
Толкование результатов теста восстановления метгемоглобина. В принципе (когда эритроциты содержат достаточное количество Г-6-ПД) после трехчасовой инкубации почти все количество образуемого метгемоглобина под воздействием нитрата натрия восстанавливается и содержащаяся во 2 пробирке проба приобретает одинаковый красный цвет с пробой пробирки 1 (в содержимое которой не добавили нитрит натрия).
Когда концентрация Г-6-ПД недостаточна гемолизат пробирки 2 приобретает коричневый цвет, как в пробирке 3, поскольку восстановление метгемоглобина не протекало нормально. У гетерозиготных женщин цвет колеблется в зависимости от степени проявления дефицита.
Это исследование несложно, не требует особых веществ и дорогостоящей аппаратуры. В то же время располагает достаточной чувствительностью для выявления, в пропорции 85%, небольших дефицитов встречаемых у гетерозиготов.
