Тест аутогемолиза эритроцитов - методика, показатели нормы
Принцип теста аутогемолиза эритроцитов. Хранение эритроцитов в аутологической сыворотке, в течение нескольких дней обусловливает развитие постепенного гемолиза, который обретает более резкий характер при наследственном сфероцитозе.
Материалы и реагенты теста аутогемолиза эритроцитов: стерильные флаконы Эрленмайера с 10— 20 стеклянными шариками 2—4 мм; чаши для центрифуги вместимостью 10 мл, стерильные и закупоривающиеся пробкой; стерильные пипетки на 0,1 и 1 мл; пробирки на 10/100 мм; штативы; фотоколориметр; стерильную глюкозу в виде 10% раствора в 8,5% растворе NaCl; 8.5‰; стерильный раствор NaCl; раствор 0,01М NH4OH.
Техника теста аутогемолиза эритроцитов. В 4 стерильные чаши для центрифуги, закрытые резиновыми пробками, из которых в двух находится по 0,1 мл 8,5‰ раствора NaCl, а в других двух по 0,1 мл стерильного 10% раствора глюкозы влить по 2 мл крови, стерильно отобранной в флакон Эрленмайера и предварительно дефибринированной путем встряхивания в посуде со стеклянными шариками.
Далее все четыре чаши подвергаются инкубации в течение 24 и 48 часов, при температуре 37°С, при этом после каждого интервала содержимое гомогенизируется путем легкого вращения. Затем из одной чаши, содержащей глюкозу и из другой, не содержащей глюкозу, отобрать по 0,2 мл крови и влить в 10 мл раствора NH4OH, в виду определения концентрации гемоглобина.
Для каждой из проб определить гематокрит. Остаток каждой пробы процентрифугировать; из надосадочной массы (сыворотки) отобрать по 0,2 мл и влить в 10 мл раствора NH4OH. Определить оптическую плотность при 540 нм или с помощью зеленого фильтра.
Прочет результата на гемолизате цельной крови провести по сравнению с раствором NH4OH, в то время как на сывороточной пробе — по сравнению со смесью 0,2 мл предварительно поддвергнутой инкубации сыворотки и 10 мл раствора NH4OH.
Расчет, толкование результатов теста аутогемолиза эритроцитов. В процентном выражении гемолиз расчитывается по формуле: % гемолиза = ОПСт (100 — Гктт) / (ОПБт х 10), где: ОПСт = оптическая плотность, получаемая от сыворотки во время Т (24 и 48 ч.); Гктт = гематокрит во время Т; ОПБт == оптическая плотность, получаемая от пробы крови во время Т.
В нормальной пробе, лишенной глюкозы, аутогемолиз спустя 48 часов составляет 3,5%, а в присутствии глюкозы — менее 0,6%. Аутогемолиз завышен при наследственном сфероцитозе, однако недостаток исправим почти полностью добавлением глюкозы.
Умеренный (3—6%) и исправимый, с помощью глюкозы, аутогемолиз встречается при несфероцитной врожденной гемолитической анемии, отнесенной к типу I, в то время как выраженный аутогемолиз (7— 15%), не сокращающийся в присутствии глюкозы, характеризует несфероцитную врожденную гемолитическую анемию типа 2.