Тест на осмотическую резистентность эритроцитов - методика, показатели нормы
Принцип теста на осмотическую резистентность эритроцитов. При погружении эритроцитов в гипотонический раствор наблюдается сокращение отношения площадь/объем с последующим набуханием и расплавлением. Испытание заключается в фотоколориметринеском определении гемоглобина, выделяемого эритроцитами, погруженчыми в солевой раствор, гипотонические значения которого повышаются.
Материалы, реагенты для теста на осмотическую резистентность эритроцитов: пробирки на 10/100 мм; градуированные пипетки на 1 и 2 мл; штативы; флаконы на 100 мл; фотоколориметр; солевой раствор — запас: 18 г NaCl; 2,73г Na2HPО4; 0,374 г NaH2PО4; 200 мл дистилированной воды. Приготовленный таким образом раствор сохраняется месяцами в закупоренном пробкой флаконе.
Из запасного раствора приготовляются гипотонические растворы следующих концентраций: 0,9, 0,75, 0,65, 0,60, 0,55, 0,50, 0,45, 0,40, 0,35, 0,30, 0,20, также 0,10% NaCl, в объемах 50 мл, которые сохраняются несколько недель при температуре +4°С. Гипотонический раствор приготовляется следующим образом: 13 флаконов на 100 мл помечаются цифрой желаемого получить разведения солевого раствора; из имеющегося в запасе раствора отбираем объем в 10 раз больше отмеченной на флаконе цифры (напр., в флакон, на котором отмечено 0,15% влить 1,5 мл), затем до 100 мл дополнить дистилированной водой.
Эритроциты извлекаются из гепаринизованной или дефибринированной свежеотобранной крови.
Техника теста на осмотическую резистентность эритроцитов. В чашу центрифуги влить по 10 мл из каждого раствора. В другую чашу, помеченную, «0» влить 10 мл дистилированной воды.
Нормальные значения гемолиза
Затем в каждую из чаш добавить по 0,1 мл осадка эритроцитов, прогомогенизировать содержимое опрокидыванием посуды и продержать 60 мин. в комнатной температуре. По истечении этого интервала взвесь процентрифугировать для выпадения нерасплавленных эритроцитов и клеточных остатков и отобрать надосадочную массу. В чаше, помеченной «0» гемолиз должен быть полным. Определить оптическую плотность надосадочной массы при 540 нм (или зеленом фильтре) соответственно каждой концентрации солевого раствора. Прочет сделать по сравнению с взвесью эритроцитов, находящихся в чаше с 0,9% NaCl.
Дополнительно определение осмотической резистентность можно провести и на предварительно подвергнутых инкубации эритроцитах, при 37°С. С этой целью 2 мл стерильно отобранной на гепарине крови влить в простерилизованную и закупоренную пробкой чашу центрифуги, вместимостью 10 мл и подвергнуть суточной инкубации, при температуре 37СС. Затем определить осмотическую хрупкость, как описано выше.
Расчет, толкование результатов теста на осмотическую резистентность эритроцитов. В процентном выражении гемолиз каждой чаши расчитывается по формуле: % гемолиза = ОП пробы/ОП в чаше «О» х 100.
Нормальные значения приведены в таблице выше.
Повышенная осмотическая резистентность встречается при наследственном сфероцитозе, когда она стойкая после инкубации, также при аутоиммунной гемолитической анемии.
Высокая устойчивость к расплавлению отмечается при гомо- и гетерозиготной талассемии, железодефицитной анемии, после иссечения селезенки, равно как и при иных обстоятельствах увеличения площади эритроцита.